RNAi幹擾檢測(cè)

簡(jiǎn)要(yào)描(miáo)述(shù)：RNAi幹擾檢(jiǎn)測是指(zhǐ)在進化過(guò)程中(zhōng)高度保(bǎo)守的(dí)，由(yóu)雙(shuāng)鏈(liàn)RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的，同(tóng)源mRNA高(gāo)效特異性(xìng)降(jiàng)解(jiě)的現象(xiàng)。

產(chǎn)品(pǐn)型號：
廠商(shāng)性(xìng)質：生(shēng)產(chǎn)廠家(jiā)
更新時(shí)間(jiān)：2024-05-15
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產(chǎn)品(pǐn)介(jiè)紹：

RNAi幹(gān)擾(rǎo)檢(jiǎn)測 是指在進化(huà)過(guò)程中(zhōng)高(gāo)度保守的(dí)，由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘(yòu)發(fā)的(dí)，同(tóng)源mRNA高(gāo)效特(tè)異性降(jiàng)解(jiě)的現象。基(jī)因(yīn)沉默，主要有轉錄前水平(píng)的基因(yīn)沉默(TGS)和轉錄(lù)後(hòu)水(shuǐ)平的基因沉默(PTGS)兩(liǎng)類(lèi):TGS是指(zhǐ)由於DNA修(xiū)飾(shì)或染(rǎn)色體(tǐ)異(yì)染色(sè)質(zhì)化等(děng)原(yuán)因使基因不能(néng)正(zhèng)常轉(zhuǎn)錄;PTGS是(shì)啟動了細(xì)胞質內(nèi)靶mRNA序列特(tè)異性的降(jiàng)解機(jī)製。有(yǒu)時轉(zhuǎn)基(jī)因會同時導(dǎo)致TGS和PTGS。

　　RNAi幹擾檢(jiǎn)測 主體實(shí)驗(yàn)：

　　一，成(chéng)功(gōng)將siRNA表達載體導入目的細胞

　　如果目的細(xì)胞的質(zhì)粒轉染(rǎn)效率(shuài)較(jiào)低（低(dī)於70%），則應(yīng)采(cǎi)用腺(xiàn)病毒(dú)或(huò)慢(màn)病毒載(zǎi)體，利(lì)用病(bìng)毒載體(tǐ)的高感染率，高(gāo)表達特(tè)性，更(gēng)好地(dì)開展(zhǎn)RNA幹(gān)擾主體實驗。

　　二，設置好(hǎo)分組(zǔ)和對(duì)照

　　按照nature的(dí)標(biāo)準(zhǔn)，一個嚴(yán)格的RNAi介導knockdown實(shí)驗(yàn)要有6個對(duì)照：

　　⒈轉染試劑(jì)對(duì)照(zhào)（監(jiān)控轉染(rǎn)及培養(yǎng)條(tiáo)件對(duì)結果(guǒ)的影(yǐng)響）；

　　⒉nonsense siRNA對(duì)照（監(jiān)控外源(yuán)核酸本身對結(jié)果(guǒ)的影響）；

　　⒊positive siRNA對(duì)照（監控假(jiǎ)陰(yīn)性）；

　　⒋技(jì)術重(zhòng)復(fù)對照（也叫off-target 對(duì)照(zhào)，也(yě)就是(shì)利用(yòng)至少(shǎo)2個靶(bǎ)點的(dí)siRNA同(tóng)時(shí)實驗(yàn)，2個siRNA互(hù)為(wéi)off-target control，當(dāng)兩(liǎng)者的(dí)表型(xíng)相同時(shí)，才(cái)有可(kě)能(néng)是特(tè)異性的knockdown效應）；

　　⒌rescue 對(duì)照(zhào)（knockdown之後做超表達，看是(shì)否有性狀(zhuàng)的逆轉(zhuǎn)，這也是(shì)為了說明knockdown的特(tè)異性(xìng)）；6.全表(biǎo)達(dá)組(zǔ)掃(sǎo)描對(duì)照（就(jiù)是轉(zhuǎn)錄/表(biǎo)達(dá)芯片掃描，以(yǐ)zui終(zhōng)確定(dìng)表型(xíng)不(bù)是由於(yú)off-target造成）。

　　實(shí)際實驗(yàn)中，全(quán)表達組掃描(miáo)對照(zhào)很少(shǎo)有文獻(xiàn)涉(shè)及(jí)。其它幾個對照(zhào)中(zhōng)，1,2兩(liǎng)種(zhǒng)對照即所(suǒ)謂的空白細胞對照(zhào)，NC對(duì)照(zhào)，基(jī)本(běn)是所有(yǒu)雜誌(zhì)都要求(qiú)具(jù)備(bèi)的(dí)。4,5兩(liǎng)種對照(zhào)，主要是為了(liǎo)解(jiě)決off-target效應，選做一(yī)種即可(kě)，一般(bān)建(jiàn)議選(xuǎn)5，涉(shè)及的實(shí)驗(yàn)即所謂的“RNA幹擾回復實(shí)驗"。

　　三，RNA幹擾(rǎo)效(xiào)率的檢(jiǎn)測(cè)（體外(wài)）

　　一般(bān)應該(gāi)從(cóng)mRNA水平，蛋白(bái)質(zhì)水(shuǐ)平，細胞表(biǎo)型(xíng)水平三(sān)個層次(cì)來(lái)檢測幹(gān)擾效率。

　　mRNA水(shuǐ)平：RT-PCR，Real-time PCR；蛋(dàn)白(bái)質水平：Western-blot，ELISA，免疫(yì)組(zǔ)化；細胞表型(xíng)水平：MTT，克隆(lóng)形(xíng)成(chéng)實驗(yàn)，流(liú)式細(xì)胞(bāo)檢(jiǎn)測(cè)，細(xì)胞(bāo)小室(shì)實(shí)驗等(děng)。RNA幹(gān)擾(rǎo)效(xiào)率在(zài)動(dòng)物(wù)模型上的進一步驗(yàn)證(zhèng)（體內）　動(dòng)物模型實(shí)驗可以(yǐ)采取“體(tǐ)內法"和“體外(wài)法"。

　　體內法，即(jí)先做裸鼠(shǔ)成瘤模型(xíng)，再(zài)將(jiāng)質粒(lì)或病毒導入裸(luǒ)鼠，檢(jiǎn)測RNA幹擾(rǎo)效果。此法(fǎ)操作(zuò)復雜，對質粒和(hé)病毒產(chǎn)品的質和量要(yào)求都(dū)較高，但是比(bǐ)較貼(tiē)近實(shí)際(jì)，說服力(lì)較(jiào)顯著。體(tǐ)外法，即先(xiān)將(jiāng)質粒(lì)或病毒(dú)導(dǎo)入腫(zhǒng)瘤(liú)細(xì)胞(bāo)，再將腫瘤細胞(bāo)導入(rù)動物體(tǐ)內，然後檢測RNA幹擾(rǎo)效(xiào)果。此(cǐ)法操(cāo)作較(jiào)簡單，對質(zhì)粒和病毒(dú)產(chǎn)品的質(zhì)量要(yào)求(qiú)較(jiào)低，所(suǒ)以(yǐ)為大多(duō)數文獻所采(cǎi)用(yòng)。建議采用(yòng)此(cǐ)方(fāng)法來進行動物模(mó)型水(shuǐ)平的實驗(yàn)。