RNAi幹擾檢(jiǎn)測(cè)技術(shù)要(yào)點

 　　RNAi幹擾(rǎo)檢測技術要(yào)點(diǎn)
　　RNAi幹(gān)擾檢(jiǎn)測(cè) 是(shì)指在進化過程(chéng)中高(gāo)度保守的，由(yóu)雙鏈(liàn)RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的，同(tóng)源mRNA特(tè)異性降解的現(xiàn)象。基因沉默，主要有轉錄前水平(píng)的(dí)基因沉默(TGS)和(hé)轉錄(lù)後水(shuǐ)平的基(jī)因沉默(PTGS)兩(liǎng)類:TGS是(shì)指由(yóu)於DNA修(xiū)飾或染(rǎn)色(sè)體(tǐ)異染色(sè)質(zhì)化(huà)等(děng)原因(yīn)使基因不(bù)能(néng)正(zhèng)常(cháng)轉錄(lù);PTGS是(shì)啟動了細(xì)胞質(zhì)內靶(bǎ)mRNA序(xù)列(liè)特(tè)異性的降解(jiě)機(jī)製(zhì)。有時轉(zhuǎn)基(jī)因會同時(shí)導致TGS和PTGS。
　　RNAi幹擾(rǎo)檢(jiǎn)測 主體實驗(yàn)：
　　一，成功將siRNA表達載體導入(rù)目的(dí)細胞(bāo)
　　如(rú)果目的細(xì)胞的質粒(lì)轉(zhuǎn)染效率(shuài)較(jiào)低（低(dī)於(yú)70%），則應采用(yòng)腺(xiàn)病毒(dú)或(huò)慢病(bìng)毒載體(tǐ)，利(lì)用(yòng)病(bìng)毒載(zǎi)體(tǐ)的高(gāo)感染(rǎn)率(shuài)，高表達特(tè)性，更(gēng)好(hǎo)地開(kāi)展RNA幹擾主(zhǔ)體實驗。
　　二，設(shè)置(zhì)好分組和對照
　　按(àn)照(zhào)nature的標(biāo)準，一個嚴(yán)格的(dí)RNAi介(jiè)導(dǎo)knockdown實驗要有(yǒu)6個對照：
　　⒈轉染(rǎn)試劑對(duì)照（監(jiān)控轉染(rǎn)及(jí)培(péi)養條件對結果的影響）；
　　⒉nonsense siRNA對(duì)照（監控(kòng)外源(yuán)核(hé)酸本(běn)身(shēn)對(duì)結果的影(yǐng)響）；
　　⒊positive siRNA對(duì)照(zhào)（監控假陰性）；
　　⒋技術(shù)重(zhòng)復對(duì)照(zhào)（也(yě)叫off-target 對照，也就是利(lì)用至(zhì)少2個(gè)靶(bǎ)點的siRNA同時實驗(yàn)，2個(gè)siRNA互(hù)為off-target control，當(dāng)兩者(zhě)的(dí)表型(xíng)相(xiāng)同時，才有可能是特(tè)異(yì)性(xìng)的(dí)knockdown效應(yīng)）；
　　⒌rescue 對(duì)照（knockdown之後做超(chāo)表(biǎo)達(dá)，看(kàn)是(shì)否(fǒu)有性狀的逆(nì)轉(zhuǎn)，這也是為(wéi)了(liǎo)說明knockdown的(dí)特異(yì)性）；6.全(quán)表(biǎo)達(dá)組掃描對照(zhào)（就(jiù)是(shì)轉錄(lù)/表(biǎo)達芯(xīn)片掃描(miáo)，以(yǐ)zui終確定表型不是(shì)由(yóu)於off-target造(zào)成(chéng)）。
　　實(shí)際(jì)實驗中，全表(biǎo)達組(zǔ)掃描(miáo)對(duì)照很(hěn)少(shǎo)有(yǒu)文獻涉(shè)及(jí)。其它(tā)幾個對照中(zhōng)，1,2兩種(zhǒng)對照(zhào)即(jí)所(suǒ)謂(wèi)的空白細胞對(duì)照，NC對(duì)照(zhào)，基(jī)本是所(suǒ)有雜(zá)誌(zhì)都(dū)要求具備的。4,5兩種(zhǒng)對照，主要(yào)是為了(liǎo)解決off-target效應(yīng)，選做一種(zhǒng)即可，一般建議選5，涉及(jí)的(dí)實驗即(jí)所(suǒ)謂(wèi)的“RNA幹(gān)擾(rǎo)回復實驗”，
　　三，RNA幹(gān)擾效率(shuài)的檢測(cè)（體外）
　　一般應(yīng)該(gāi)從mRNA水平，蛋白(bái)質水平，細胞(bāo)表(biǎo)型(xíng)水平(píng)三個層次來檢(jiǎn)測幹擾效率(shuài)。
　　mRNA水(shuǐ)平(píng)：RT-PCR，Real-time PCR；蛋(dàn)白(bái)質水平：Western-blot，ELISA，免(miǎn)疫組(zǔ)化；細(xì)胞(bāo)表型(xíng)水(shuǐ)平：MTT，克隆形成實驗(yàn)，流(liú)式細胞檢測，細(xì)胞小室實驗等。RNA幹擾(rǎo)效(xiào)率在(zài)動物(wù)模(mó)型(xíng)上的進(jìn)一(yī)步(bù)驗(yàn)證(zhèng)（體(tǐ)內）　動物模型實驗可以采取“體內法(fǎ)”和“體外(wài)法(fǎ)”。
　　體內(nèi)法(fǎ)，即先(xiān)做裸鼠成(chéng)瘤模(mó)型(xíng)，再(zài)將(jiāng)質粒或病毒導入(rù)裸鼠(shǔ)，檢(jiǎn)測RNA幹擾效果。此法操作復雜(zá)，對質粒(lì)和(hé)病(bìng)毒產(chǎn)品的質和(hé)量要求(qiú)都較(jiào)高，但是(shì)比(bǐ)較貼(tiē)近實際(jì)，說服(fú)力(lì)較(jiào)顯(xiǎn)著。體外(wài)法(fǎ)，即(jí)先(xiān)將(jiāng)質(zhì)粒或病毒導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞(bāo)，再(zài)將腫瘤(liú)細(xì)胞(bāo)導(dǎo)入(rù)動(dòng)物體內(nèi)，然(rán)後檢(jiǎn)測RNA幹擾(rǎo)效(xiào)果。此法操(cāo)作較簡(jiǎn)單(dān)，對(duì)質粒和病毒產品的(dí)質量要求較(jiào)低(dī)，所以為大多數文獻所采用。建(jiàn)議(yì)采(cǎi)用此方法來(lái)進(jìn)行動物模(mó)型(xíng)水平的實驗。