淺(qiǎn)析慢病毒載(zǎi)體

    慢病毒載體(tǐ)（ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病(bìng)毒基礎上(shàng)改造而成(chéng)的(dí)病毒(dú)載體(tǐ)係統(tǒng)，它能的(dí)將(jiāng)目的(dí)基(jī)因（或 RNAi ）導入動(dòng)物和人(rén)的(dí)原代細(xì)胞(bāo)或細胞係(xì)。慢病毒載(zǎi)體基(jī)因組(zǔ)是(shì)正鏈(liàn) RNA ，其基因組(zǔ)進入(rù)細(xì)胞後，在細(xì)胞漿(jiāng)中(zhōng)被(bèi)其自身攜帶(dài)的反轉錄酶(méi)反(fǎn)轉為 DNA ，形成(chéng) DNA 整(zhěng)合前復(fù)合體(tǐ)，進(jìn)入細胞核後， DNA 整(zhěng)合到細胞基因組中(zhōng)。整(zhěng)合後的(dí) DNA 轉錄 mRNA ，回(huí)到細胞漿(jiāng)中(zhōng)，表(biǎo)達(dá)目的(dí)蛋(dàn)白；或產(chǎn)生 RNAi 幹(gān)擾(rǎo)。

    慢病(bìng)毒載體(tǐ)介導的基(jī)因(yīn)表(biǎo)達或 RNAi 幹(gān)擾作用持(chí)續且穩定，原因是目的基(jī)因(yīn)整合到宿主細胞基因(yīn)組(zǔ)中，並(bìng)隨(suí)細胞(bāo)基(jī)因組(zǔ)的分(fēn)裂而分裂。另外，慢(màn)病毒(dú)載體(tǐ)能有效感(gǎn)染並整合到非分裂(liè)細胞中。以(yǐ)上(shàng)特性(xìng)使慢病(bìng)毒(dú)載(zǎi)體與其它(tā)病(bìng)毒載(zǎi)體相(xiāng)比，比(bǐ)如不整合的腺(xiàn)病(bìng)毒載體(tǐ)，整合率(shuài)低的腺(xiàn)相關(guān)病毒載(zǎi)體(tǐ)，隻整(zhěng)合(hé)分裂細胞(bāo)的(dí)傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒(dú)載體，有鮮(xiān)明的(dí)特(tè)色(sè)。大(dà)量(liáng)文(wén)獻(xiàn)研(yán)究表明，慢(màn)病毒(dú)載(zǎi)體介(jiè)導的(dí)目的基(jī)因(yīn)長期表達(dá)的(dí)組織或(huò)細(xì)胞包(bāo)括腦，肝髒(zàng)，肌肉，視網(wǎng)膜，造血(xiě)幹(gān)細胞，骨髓間充質(zhì)幹細胞(bāo)，巨噬(shì)細胞(bāo)等(děng)。

    慢病毒(dú)載體不表(biǎo)達(dá)任何 HIV-1 蛋白，免疫(yì)原性(xìng)低，在(zài)注射(shè)部位(wèi)無(wú)細胞免(miǎn)疫反(fǎn)應，體液(yè)免疫反應(yīng)也(yě)較低(dī)，不(bù)影響病毒(dú)載體的(dí)第(dì) 2 次(cì)注(zhù)射(shè)。

 

1. 構(gòu)建原(yuán)理

   慢(màn)病毒屬於逆轉(zhuǎn)錄病(bìng)毒科(kē)，但(dàn)其基因(yīn)組(zǔ)結(jié)構復(fù)雜(zá)，除 gag，pol 和 env 這 3 個和單純(chún)逆(nì)轉(zhuǎn)錄病毒(dú)相似的(dí)結(jié)構基(jī)因外，還包括(kuò) 4 個輔助基(jī)因(yīn)，vif，vpr，nef，vpu 和 2 個調節(jié)基因 tat 和 rev 。 HIV 21 是慢(màn)病毒中(zhōng)特(tè)征性的(dí)病毒，*個(gè)慢(màn)病毒(dú)載(zǎi)體係統即以(yǐ)此病(bìng)毒(dú)為基礎進行(háng)構建的。慢(màn)病毒(dú)載(zǎi)體(tǐ)的構建原理就(jiù)是將 HIV 21 基(jī)因組中(zhōng)的(dí)順式作用(yòng)元(yuán)件(jiàn) （ 如(rú)包裝(zhuāng)信號(hào)，長末(mò)端重復(fù)序列 ） 和編碼(mǎ)反(fǎn)式作用蛋白的(dí)序(xù)列進(jìn)行分離。載體係統包括包(bāo)裝成分和載體成分
：包裝(zhuāng)成分由(yóu) HIV 21 基因(yīn)組去(qù)除了(liǎo)包裝(zhuāng)，逆轉(zhuǎn)錄(lù)和整(zhěng)合所(suǒ)需的(dí)順式(shì)作用序(xù)列(liè)而構(gòu)建，能反(fǎn)式提(tí)供產(chǎn)生病毒顆粒(lì)所需的(dí)蛋(dàn)白；載體成(chéng)分與包裝(zhuāng)成(chéng)分(fēn)互補，含有包(bāo)裝，逆轉錄和(hé)整合所需(xū)的(dí) HIV 21順(shùn)式作用(yòng)序(xù)列。

    同時(shí)具有(yǒu)異源(yuán)啟(qǐ)動(dòng)子控製(zhì)下的多克(kè)隆位點(diǎn)及在此(cǐ)位點插入的目的(dí)基因。為降(jiàng)低(dī)兩(liǎng)種成(chéng)分同源重(zhòng)組產生有復製(zhì)能(néng)力的(dí)病毒 （RCV ） 的可能(néng)性，將包裝成(chéng)分的(dí) 5 ′ LTR 換成(chéng)巨(jù)細胞病毒(dú) （CMV ） 立即(jí)早(zǎo)期啟(qǐ)動(dòng)子(zǐ)，3 ′ LTR 換成 SV 40 polyA 位點等。將包裝成(chéng)分分(fēn)別構(gòu)建(jiàn)在兩(liǎng)個質粒(lì)上，即一(yī)個(gè)表達 gag 和 pol，另一(yī)個(gè)表達(dá) env 。根據這(zhè)個原理，Naldini 和(hé) Kafri 等(děng)構建了(liǎo)三(sān)質(zhì)粒(lì)表達係統。

2. 三質粒(lì)表達係(xì)統(tǒng)

    三質(zhì)粒表達(dá)係(xì)統包括包(bāo)裝質(zhì)粒，包(bāo)膜(mó)蛋白質(zhì)粒和(hé)轉移質(zhì)粒。其中(zhōng)包(bāo)裝質(zhì)粒(lì)在 CMV 啟(qǐ)動子(zǐ)的(dí)控(kòng)製下，表達 HIV 21 復製(zhì)所需的全部反式激活蛋白，但(dàn)不(bù)產生病(bìng)毒包膜蛋白(bái)及輔(fǔ)助(zhù)蛋白(bái) vpu；包膜(mó)蛋白(bái)質粒編碼水(shuǐ)泡性口炎病(bìng)毒(dú) G 蛋白(bái) （V SV 2G），應(yīng)用 VSV 2G 包膜的假(jiǎ)構型慢(màn)病毒載(zǎi)體擴(kuò)大(dà)了(liǎo)載(zǎi)體的靶細(xì)胞(bāo)嗜性範(fàn)圍，而且增加了(liǎo)載(zǎi)體的(dí)穩定(dìng)性(xìng)，允許(xǔ)通過高(gāo)速離(lí)心對載體進行(háng)濃(nóng)縮(suō)，提(tí)高了(liǎo)滴(dī)度； 轉移(yí)質粒中(zhōng)除(chú)含(hán)有包(bāo)裝(zhuāng)，逆轉錄及整合所需(xū)的(dí)順式序(xù)列，還保留(liú) 350 bp 的 gag 和(hé) RRE，並(bìng)在其中插入目(mù)的(dí)基(jī)因(yīn)或(huò)標誌基(jī)因 （ 綠(lǜ)色(sè)熒(yíng)光蛋白(bái) GFP） 。將載(zǎi)體係統分(fēn)成三個(gè)質(zhì)粒zui大的益處(chǔ)是使(shǐ)序(xù)列(liè)重(zhòng)疊的機會大大(dà)減少(shǎo)，減(jiǎn)少載(zǎi)體重(zhòng)組過(guò)程中(zhōng)產生(shēng) RCV 的(dí)可(kě)能性(xìng)。通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細胞(bāo)，超(chāo)速離心後(hòu)病毒滴度(dù)可達 109IU /m l 。

3. 四質粒(lì)表達(dá)係統(tǒng)

    為了(liǎo)減少 HIV 21 包裝(zhuāng)結構的(dí)序列同源(yuán)性，進一(yī)步減(jiǎn)少(shǎo)重組成 RCV 的可能性，Dull 等人(rén)將輔助(zhù)基(jī)因(yīn)去(qù)除(chú)。但(dàn)由於 gag2pol 的轉(zhuǎn)運需(xū)要(yào) rev，因(yīn)此(cǐ)，在上(shàng)述的三質粒(lì)係統的基礎上，構建(jiàn)成(chéng)四(sì)質(zhì)粒表達係(xì)統(tǒng)，該(gāi)係統(tǒng)加上(shàng)含 rev 的(dí)質粒減少(shǎo)了(liǎo)產(chǎn)生 RCV 的可(kě)能(néng)性(xìng)，而(ér)且(qiě)對非分裂期細胞(bāo)轉導效率(shuài)無(wú)影響。

 

1. 將(jiāng)目(mù)的(dí)基因 /RNAi 基(jī)因轉入(rù)難(nán)以(yǐ)轉染的細胞(bāo)，比如(rú)神(shén)經元細(xì)胞，幹細胞(bāo)或其(qí)它原代細胞(bāo)；

2. 將(jiāng)目的基(jī)因 /RNAi 基(jī)因(yīn)轉入(rù)動物(wù)組(zǔ)織，以期獲(huò)得長期表達；

3. 構建穩定表達目的(dí)蛋白(bái) /RNAi 的細(xì)胞係(xì)，再用exvivo的(dí)方(fāng)法導入(rù)動(dòng)物體(tǐ)內(nèi)；

4. 基因治(zhì)療；

5. 轉基因(yīn)動(dòng)物(wù)；

6. 基因敲(qiāo)除；

7. 藥物研究(jiū)
：構建(jiàn)表達(dá)受體蛋(dàn)白(bái)的(dí)細(xì)胞係，研(yán)究藥物的作用；

8. 快(kuài)速(sù)建(jiàn)立生(shēng)產目(mù)的蛋白的細(xì)胞(bāo)係(xì)，非常有前(qián)途的真核細胞表達方法。

 

    慢(màn)病毒(dú)（ Lentivirus ）載體(tǐ)是以 HIV-1 （人(rén)類免疫缺陷(xiàn) I 型病毒）為(wéi)基(jī)礎(chǔ)發(fā)展起來的基(jī)因治(zhì)療載體(tǐ)。區別一般的逆轉錄病(bìng)毒(dú)載體，它(tā)對分裂細胞(bāo)和非分裂細胞(bāo)均(jūn)具有(yǒu)感(gǎn)染能力。慢病毒(dú)載體的研(yán)究發(fā)展(zhǎn)得很快(kuài)，研究(jiū)的(dí)也非(fēi)常(cháng)深入。該載體(tǐ)可(kě)以(yǐ)將(jiāng)外(wài)源基(jī)因(yīn)有效地整合到宿主染色(sè)體(tǐ)上，從(cóng)而達(dá)到(dào)持久性(xìng)表(biǎo)達。在感染能(néng)力(lì)方(fāng)麵可有效地感(gǎn)染神經元(yuán)細胞，肝(gān)細(xì)胞，心肌(jī)細胞，腫瘤細(xì)胞，內皮細胞，幹細(xì)胞等多種類(lèi)型的細胞(bāo)，從而(ér)達到(dào)良好的的基因治(zhì)療(liáo)效果，在(zài)美國已(yǐ)經(jīng)開(kāi)展了臨(lín)床(chuáng)研究(jiū)，效果非常理(lǐ)想(xiǎng)，因(yīn)此具有(yǒu)廣闊的(dí)應(yīng)用前景。