慢(màn)病(bìng)毒包裝(zhuāng)概(gài)述及(jí)步驟

    目前慢(màn)病毒也(yě)被廣泛(fàn)地(dì)應(yīng)用於表達(dá) RNAi 的(dí)研究中(zhōng)。

    由於(yú)有些(xiē)類型細胞脂質體轉染(rǎn)效果(guǒ)差(chà)，轉(zhuǎn)移(yí)到(dào)細(xì)胞內(nèi)的(dí) siRNA 半(bàn)衰期短，體外合成(chéng) siRNA 對基因表(biǎo)達的(dí)抑製作(zuò)用通常(cháng)是(shì)短(duǎn)暫的，因(yīn)而使其(qí)應用受到較大的限製(zhì)。采用(yòng)事(shì)先(xiān)在體外構建(jiàn)能(néng)夠表達 siRNA 的載體，然後(hòu)轉移(yí)到細胞(bāo)內轉錄 siRNA 的(dí)策略(lüè)，不(bù)但(dàn)使脂(zhī)質(zhì)體有(yǒu)效(xiào)轉染(rǎn)的(dí)細胞種類(lèi)增加，而(ér)且(qiě)對基因表達(dá)抑(yì)製效果也不遜色於(yú)體外合成 siRNA ，在長期穩定表達(dá)載體的(dí)細胞中，甚至可以(yǐ)發揮(huī)長期(qī)阻斷(duàn)基因表(biǎo)達(dá)的作(zuò)用。在所(suǒ)構建的 siRNA 表(biǎo)達載(zǎi)體中，是由 RNA 聚(jù)合(hé)酶Ⅲ啟動(dòng)子來(lái)指(zhǐ)導 RNA 合成(chéng)的，這是因(yīn)為 RNA 聚合酶(méi)Ⅲ有明確的(dí)起(qǐ)始和終止(zhǐ)序列(liè)，而(ér)且合成的(dí) RNA 不(bù)會帶 poly A 尾(wěi)。當 RNA 聚(jù)合(hé)酶Ⅲ遇到連續 4 個(gè)或(huò) 5 個 T 時，它指導的轉(zhuǎn)錄就(jiù)會停止，在轉錄(lù)產(chǎn)物 3' 端形(xíng)成(chéng) 1~4 個(gè)U 。 U6 和 H1 RNA 啟(qǐ)動子是兩種 RNA 聚合(hé)酶Ⅲ依(yī)賴的(dí)啟(qǐ)動子(zǐ)，其特點是啟動(dòng)子自身元(yuán)素(sù)均(jūn)位於轉錄(lù)區的上遊，適合於表(biǎo)達(dá)～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 莖(jīng)環結(jié)構（ stem loop ）。在(zài) siRNA 表達(dá)載體中(zhōng)，構(gòu)成 siRNA 的正(zhèng)義(yì)與反義(yì)鏈(liàn)，可由(yóu)各自(zì)的啟(qǐ)動(dòng)子分(fēn)別轉(zhuǎn)錄，然(rán)後(hòu)兩(liǎng)條(tiáo)鏈互(hù)補(bǔ)結合形成 siRNA ；也(yě)可由(yóu)載體直接表(biǎo)達小(xiǎo)發卡(qiǎ)狀(zhuàng) RNA（small hairpin RNA, shRNA），載體(tǐ)包(bāo)含位(wèi)於(yú) RNA 聚合酶(méi)Ⅲ啟(qǐ)動子(zǐ)和 4 ～ 5 T轉錄終止(zhǐ)位點(diǎn)之間的莖環結(jié)構序列，轉(zhuǎn)錄(lù)後(hòu)即可折(zhē)疊成具有(yǒu) 1~4 個 U 3 ' 突出(chū)端(duān)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在(zài)細(xì)胞(bāo)內進一步加工成 siRNA 。構建載體前(qián)通常要(yào)通過(guò)合成(chéng) siRNA 的方(fāng)法，尋找的 siRNA ，然後(hòu)從中挑選(xuǎn)符合載(zǎi)體(tǐ)要(yào)求(qiú)的(dí)序列(liè)，將(jiāng)其引入 siRNA 表(biǎo)達(dá)載體。

     慢(màn)病毒(dú)載(zǎi)體（ Lentiviral vector ）較逆(nì)轉錄病毒載體有更廣的宿(sù)主範圍，慢(màn)病毒能夠有效(xiào)感(gǎn)染非(fēi)周期(qī)性和(hé)有絲(sī)分裂(liè)後(hòu)的細胞(bāo)。慢(màn)病(bìng)毒(dú)載體能夠產(chǎn)生(shēng)表達 shRNA 的(dí)高滴(dī)度的慢病毒，在(zài)周期性和非周期性細胞，幹細胞，受(shòu)精(jīng)卵以(yǐ)及分(fēn)化(huà)的後(hòu)代細胞中(zhōng)表達(dá) shRNA ，實(shí)現在(zài)多種類型(xíng)的細(xì)胞和(hé)轉基(jī)因(yīn)小鼠(shǔ)中特(tè)異而穩定的基因表達(dá)的(dí)功(gōng)能(néng)性(xìng)沉(chén)默，為在原代的(dí)人和(hé)動(dòng)物細胞組織中快(kuài)速而(ér)地研(yán)究(jiū)基(jī)因(yīn)功能(néng)，以及(jí)產生特定(dìng)基(jī)因表達降低的動物提供(gōng)了(liǎo)可(kě)能(néng)性(xìng)。

     慢病(bìng)毒表達(dá)載體(tǐ)包(bāo)含了(liǎo)包裝，轉染，穩(wěn)定(dìng)整合(hé)所(suǒ)需要的遺傳信息(xī)。慢病毒包裝質(zhì)粒可(kě)提供(gōng)所有(yǒu)的轉錄(lù)並(bìng)包(bāo)裝(zhuāng) RNA 到(dào)重(zhòng)組(zǔ)的假(jiǎ)病毒(dú)載體所(suǒ)需要(yào)的(dí)所有(yǒu)輔(fǔ)助蛋(dàn)白(bái)。為產生高(gāo)滴度的病毒顆(kē)粒，需(xū)要利(lì)用(yòng)表達載(zǎi)體(tǐ)和包(bāo)裝質(zhì)粒(lì)同時共(gòng)轉染(rǎn)細(xì)胞，在細胞中進行病毒(dú)的包裝，包裝(zhuāng)好的假病毒顆(kē)粒分泌到(dào)細胞外的(dí)培養基(jī)中(zhōng)，離(lí)心取得(dé)上(shàng)清(qīng)液(yè)後，可(kě)以直接(jiē)用於(yú)宿主(zhǔ)細胞(bāo)的感(gǎn)染(rǎn)，目的(dí)基(jī)因(yīn)進入到宿主(zhǔ)細胞之(zhī)後(hòu)，經過反轉錄，整合到基因組，從而高(gāo)水平(píng)的表達(dá)效應(yīng)分(fēn)子。



 

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1. 對於一(yī)些較(jiào)難(nán)轉(zhuǎn)染(rǎn)的細(xì)胞(bāo)，如原代細胞，幹細(xì)胞，不分(fēn)化(huà)的(dí)細胞等，能大(dà)大提高目(mù)的基因(yīn)轉導效(xiào)率，而且(qiě)目的基(jī)因整合(hé)到(dào)宿主細胞基因(yīn)組(zǔ)的幾(jī)率(shuài)大大(dà)增加(jiā)，這就(jiù)為 RNAi，cDNA 克隆以及(jí)報(bào)告(gào)基因的(dí)研(yán)究提(tí)供(gōng)了一個有利(lì)的途(tú)徑。

2. 進(jìn)行穩(wěn)轉細胞(bāo)株的(dí)篩選(xuǎn)；

3. 為活體(tǐ)動(dòng)物(wù)模型實(shí)驗提(tí)供高(gāo)質(zhì)量(liáng)的(dí)包含(hán)目的基(jī)因(yīn)的病毒液；

在(zài)細(xì)胞(bāo)相關(guān)的(dí)實(shí)驗操(cāo)作中(zhōng)，對(duì)於一些(xiē)按常(cháng)規(guī)方(fāng)法難(nán)以(yǐ)轉(zhuǎn)染甚至無(wú)法轉染的細(xì)胞(bāo)，通(tōng)過(guò)病毒(dú)介導的(dí)實(shí)驗(yàn)能夠大(dà)大提(tí)高(gāo)基因(yīn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，以達(dá)到(dào)目的基因的瞬時表(biǎo)達。

 

     以六(liù)孔板(bǎn)中的(dí)1孔為例，每個樣品需(xū)要1×106個(gè)293T細胞。


     1，取1.5ml滅菌(jūn)EP管，加入1.5μg包裝混(hùn)合(hé)質(zhì)粒(lì)和(hé)0.5μg表達質(zhì)粒(lì)以及(jí)250μl的無(wú)血清培養基。輕柔混(hùn)匀(yún)，室溫孵(fū)育(yù)5min。


     2，取1.5ml滅菌EP管，取9μl 脂質(zhì)體2000l溶(róng)於250μl無血清培養基(jī)中(zhōng)。輕(qīng)柔混匀(yún)，室(shì)溫孵育(yù)5min。

     3，將(jiāng)DNA溶(róng)液(yè)和脂質體溶液(yè)輕柔(róu)混(hùn)匀。室溫(wēn)孵(fū)育(yù)20min

     4，用胰酶(méi)消(xiāo)化並記數293T細(xì)胞。用含血清(qīng)的培養(yǎng)基重懸(xuán)細胞。

     5，在(zài)六(liù)孔(kǒng)板(bǎn)中每孔，加入(rù)1ml含血(xiě)清(qīng)的生(shēng)長培(péi)養基(jī)，再加入DNA-脂(zhī)質(zhì)體復合物(wù)。

     6，將1ml重(zhòng)懸(xuán)的293T細胞（1×106個(gè)細(xì)胞/ml）加入(rù)到(dào)平板中。37℃CO2孵(fū)箱(xiāng)中孵(fū)育一晚(wǎn)。

     7，移除(chú)含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物(wù)的培(péi)養基(jī)移(yí)除，代(dài)之以DMEM（含丙酮酸(suān)鈉和(hé)非必(bì)須(xū)氨基酸）。

     8，轉染(rǎn)後(hòu)48-72h收獲含病毒(dú)的(dí)上清(qīng)。3000 rpm 離心20min，去除沉澱(diàn)。

     9，病毒上(shàng)清(qīng)-80°C貯存。

     包裝出來的慢病毒對NIH/3T3細胞達(dá)90%以上感染效(xiào)率(shuài)。

注(zhù)意事項：

      1.在慢病(bìng)毒感(gǎn)染(rǎn)細胞(bāo)前(qián)，為檢測病毒(dú)上(shàng)清培養液(yè)內病毒(dú)的(dí)活性(xìng)，並確(què)定病毒(dú)與轉染(rǎn)細(xì)胞之間的比率，需要確定(dìng)病(bìng)毒的滴度。病毒(dú)的滴度(dù)可以(yǐ)通(tōng)過轉(zhuǎn)染(rǎn)Hela細(xì)胞(bāo)，然(rán)後(hòu)使用(yòng)抗體(tǐ)篩選(xuǎn)穩(wěn)定的(dí)細(xì)胞轉染株(zhū)，進行(háng)計數和(hé)數值(zhí)統計。

      2. 在慢(màn)病毒(dú)轉染細胞(bāo)的(dí)過程中zui重要(yào)的(dí)一步是(shì)融合，隻有一些(xiē)較小(xiǎo)的(dí)慢病毒(dú)載(zǎi)體才能轉導進細(xì)胞(bāo)，因(yīn)此，病毒顆(kē)粒的(dí)吸(xī)附是慢病(bìng)毒(dú)轉染的(dí)限(xiàn)速步驟。