簡(jiǎn)述腺(xiàn)病毒包裝(zhuāng)

    腺病毒（Adenovirus，AdV）是一種無(wú)包膜的(dí)綫(xiàn)性(xìng)雙(shuāng)鏈DNA病(bìng)毒，基(jī)因組(zǔ)長(cháng)約(yuē)35000 bp，理論(lùn)上(shàng)可編碼(mǎ)22~40個(gè)基(jī)因，兩端各有長(cháng)約100~150bp的末(mò)端反向(xiàng)重復(fù)序(xù)列（ITR），在其左端(duān)ITR3，端為(wéi)長約300bp的包裝信(xìn)號（Ψ）
。病(bìng)毒顆粒(lì)直徑約(yuē)80~110 nm，病毒衣(yī)殼有(yǒu)252個殼粒，呈(chéng)規(guī)則的(dí)正二十麵體麵體(tǐ)結(jié)構(gòu)，其(qí)中包括240個(gè)六(liù)聯體和12個(gè)位於(yú)正(zhèng)二(èr)十麵(miàn)體頂部的五(wǔ)聯體(tǐ)構成
。

    腺病(bìng)毒(dú)是(shì)一種非整(zhěng)合(hé)型(xíng)雙鏈(liàn)DNA病(bìng)毒，在自(zì)然界(jiè)中廣(guǎng)泛分布(bù)
。盡管一些類型(xíng)的腺病(bìng)毒會(huì)引起人胃(wèi)腸道，呼吸(xī)係統(tǒng)或眼(yǎn)部的急(jí)性感(gǎn)染，但是應(yīng)用(yòng)於(yú)基因治療(liáo)研(yán)究(jiū)的腺病(bìng)毒(dú)是安全的，對人(rén)無(wú)致(zhì)病，致畸，致(zhì)癌的潛(qián)在危害
。

    利用基因工程(chéng)手段將腺(xiàn)病(bìng)毒基(jī)因組(zǔ)DNA改(gǎi)造成(chéng)多種基因(yīn)操作表達載體，目(mù)前常用(yòng)的腺(xiàn)病(bìng)毒包裝係統有：AdMax係統和(hé)AdEasyTM係統
。

 

    AdEasyTM 包裝(zhuāng)係統主要的特點是利(lì)用Cre/loxP係統在大(dà)腸杆菌（BJ5183）中(zhōng)完成(chéng)外(wài)源基因(yīn)插入(rù)腺病毒(dú)基(jī)因組的(dí)過程，獲(huò)得環(huán)狀(zhuàng)的重(zhòng)組腺病毒(dú)基因組(zǔ)，並(bìng)且具(jù)有在(zài)細菌中(zhōng)復(fù)製的必需元(yuán)件
。將(jiāng)重組腺病毒基(jī)因組酶(méi)切綫性化後(hòu)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，避(bì)免了(liǎo)雙質粒(lì)共(gòng)轉(zhuǎn)染得到(dào)重組腺(xiàn)病(bìng)毒
。

使用這個係統(tǒng)需要注意以(yǐ)下問題： 

（1） 要(yào)用能(néng)表達(dá)Cre重組酶的特定(dìng)的大(dà)腸杆菌，建議建立菌(jūn)種庫(kù)以(yǐ)免(miǎn)細(xì)菌(jūn)發生(shēng)變(biàn)化；

（2） 由(yóu)於重組是在(zài)細菌中(zhōng)發生(shēng)的，微小(xiǎo)的基(jī)因組(zǔ)變(biàn)化(huà)不易發現(xiàn)； 

（3） 要(yào)獲得(dé)高品質(zhì)的(dí)重組(zǔ)腺病毒(dú)毒(dú)種（高病毒產(chǎn)量，高(gāo)目的(dí)基(jī)因表達）應挑選多個(gè)重(zhòng)組腺病毒質粒(lì)，分別(bié)轉染HEK293細胞(bāo)，獲(huò)得(dé)多個重(zhòng)組(zǔ)病毒來篩選(xuǎn)
。

 

    AdMax包裝係(xì)統(tǒng)是通過Cre/loxP 獲得(dé)重(zhòng)組病毒，這個過程(chéng)發生在HEK293細胞(bāo)中，從(cóng)而避免(miǎn)在(zài)細菌中(zhōng)重(zhòng)組(zǔ)
。將克隆了外源基因(yīn)的腺病毒(dú)穿梭(suō)質(zhì)粒(lì)與(yǔ)攜帶(dài)了腺(xiàn)病(bìng)毒(dú)大部分(fēn)基因(yīn)組(zǔ)的包(bāo)裝(zhuāng)質(zhì)粒共轉染(rǎn)HEK293細(xì)胞(bāo)，利(lì)用Cre/loxP係(xì)統的作用實現重組，產(chǎn)生重組(zǔ)腺(xiàn)病(bìng)毒(dú)
。這個係統(tǒng)有多(duō)種優勢，包括(kuò)操作簡(jiǎn)便，重(zhòng)組(zǔ)效率高(gāo)，獲得的(dí)病毒產率高，目的基(jī)因的(dí)表(biǎo)達水平高(gāo)（因(yīn)為mCMV啟動(dòng)子比(bǐ)hCMV啟(qǐ)動子強若(ruò)幹(gān)倍）等
。 

    與AdEasy係(xì)統相比，AdMax係(xì)統(tǒng)有一定(dìng)的優(yōu)勢：隻需(xū)要3~4周(zhōu)就(jiù)能(néng)完成從(cóng)質(zhì)粒構建到(dào)重(zhòng)組出毒，成(chéng)功(gōng)率大(dà)於98%（其(qí)中95%的克(kè)隆(lóng)含有(yǒu)目的基因(yīn)），因在真核(hé)細(xì)胞(bāo)內重(zhòng)組出毒，保(bǎo)持了(liǎo)對腺病(bìng)毒(dú)的生(shēng)存(cún)壓力(lì)，有助(zhù)於重組腺病毒的基因(yīn)組的完整性；而AdEasy係(xì)統(tǒng)的出(chū)毒成(chéng)功率隻有18~34%（Stratagene公司新版(bǎn)的AdEasy XL係統(tǒng)成功率在(zài)94%左右），且(qiě)在細(xì)菌（BJ5183）中完成(chéng)病(bìng)毒(dú)基(jī)因(yīn)組(zǔ)重組，理(lǐ)論上，失(shī)去(qù)了(liǎo)生存壓(yā)力(lì)的腺(xiàn)病(bìng)毒基因(yīn)組(zǔ)更容易(yì)發生突(tū)變，病毒遺傳(chuán)背景及活(huó)性(xìng)可(kě)能會受到影響(xiǎng)
。

 

1，腺病(bìng)毒的(dí)基因(yīn)結(jié)構(gòu)與(yǔ)功能研(yán)究的比較清楚(chǔ)；

2，可(kě)裝入基因的容(róng)量(liáng)較大（8K）；

3，轉染(rǎn)範(fàn)圍廣，轉(zhuǎn)染(rǎn)率較高，所有腺病毒載體(tǐ)均(jūn)有(yǒu)轉(zhuǎn)染分裂期和非(fēi)分(fēn)裂期細胞的(dí)能(néng)力；

4，不(bù)整合(hé)到靶細(xì)胞(bāo)基(jī)因(yīn)組，無(wú)插(chā)入突(tū)變，無致癌(ái)性，對人無致病(bìng)，致畸，致(zhì)癌的潛在危害(hài)；

5，可以(yǐ)復製(zhì)出滴(dī)度(dù)高（可以(yǐ)達到(dào)1011 pfu/mL），穩定性(xìng)好(hǎo)，基因轉(zhuǎn)移效率高的(dí)病(bìng)毒(dú)；

6，適(shì)用於(yú)在(zài)難以(yǐ)轉染的細胞(bāo)中進(jìn)行(háng)的(dí)RNA幹擾，過(guò)表(biǎo)達特定基因或(huò)過表達(dá)特(tè)定microRNA研(yán)究和In Vivo實驗
。 

 

    重組腺病毒包裝是(shì)以Ad5血(xiě)清型E1／E3缺陷型腺(xiàn)病毒(dú)DNA為(wéi)架，在(zài)克隆(lóng)，包(bāo)裝，擴增(zēng)等各(gè)部條(tiáo)件(jiàn)做了改進(jìn)和(hé)優化，達到了克隆陽性率更高，質量(liáng)更可(kě)靠，包(bāo)裝(zhuāng)穩(wěn)定，出(chū)毒迅速，滴(dī)度(dù)高(gāo)等(děng)效(xiào)果
。在此基(jī)礎(chǔ)上(shàng)，還拓展了更廣泛的(dí)應用，可(kě)以(yǐ)提供(gōng)各(gè)種帶(dài)報告基因的(dí)，帶不同標簽(qiān)的腺病毒構(gòu)建和包裝服務(wù)
。 

    所包裝的腺病(bìng)毒已成(chéng)功應(yīng)用(yòng)於信號(hào)轉導(dǎo)，基因轉位(wèi)，Co-IP，幹細(xì)胞研(yán)究等科(kē)研實驗
。並且可(kě)以完(wán)成較高難度(dù)的(dí)克(kè)隆(lóng)構建，包括具(jù)有細胞毒(dú)性作用(yòng)基因的腺(xiàn)病毒構建，在短時間(jiān)內(nèi)完(wán)成從(cóng)原(yuán)始質粒(lì)到(dào)病(bìng)毒(dú)DNA的(dí)構建工(gōng)作
。

服(fú)務簡(jiǎn)介：

提供(gōng)各種RNA幹(gān)擾(rǎo)和基因過(guò)表(biǎo)達(dá)的腺病(bìng)毒包裝服(fú)務
。

服(fú)務內容：

    是以帶熒光(guāng)或不帶(dài)熒光的(dí)pEC3.1（+）為穿(chuān)梭(suō)載體(tǐ)，pAd/BL-Dest為(wéi)骨架載體進行(háng)的(dí)過表達(dá)病毒包裝(zhuāng)；以(yǐ)pGensil為穿梭(suō)載體，pAd/BL-Dest為骨架(jià)載(zǎi)體(tǐ)進(jìn)行幹(gān)擾病(bìng)毒(dú)的(dí)包裝(zhuāng)
。