熒光(guāng)定(dìng)量PCR檢測(cè)

簡要描述：熒光(guāng)定量PCR技(jì)術(shù)於1996年由美國Applied Biosystems公司(sī)推(tuī)出(chū)，由於(yú)該技術不僅(jǐn)實現了PCR從(cóng)定性(xìng)到定量的(dí)飛躍(yuè)，而且與常規(guī)PCR相比(bǐ)，它具(jù)有特異性更(gēng)強(qiáng)，有效(xiào)解(jiě)決(jué)PCR汙染(rǎn)問題(tí)，自動(dòng)化程度(dù)高等特(tè)點(diǎn)，目前(qián)已得(dé)到(dào)廣泛應(yīng)用;實(shí)時(shí)熒光定量PCR：在PCR反(fǎn)應體係中加入熒(yíng)光基(jī)團，利(lì)用(yòng)熒(yíng)光(guāng)信號(hào)積(jī)累實(shí)時(shí)監(jiān)測整(zhěng)個PCR進程，Z後(hòu)通(tōng)過(guò)標準(zhǔn)曲綫對(duì)未知模板進行定量(liáng)分析(xī)的(dí)方法。

產品(pǐn)型號：
廠商性質：生產廠家
更(gēng)新時間：2024-05-13
訪問量(liáng)：4112

產品咨詢聯係(xì)我們

產(chǎn)品介紹：

熒光定(dìng)量PCR技術(shù)與普(pǔ)通PCR的區別：

　　理論上PCR是(shì)一個指數(shù)增(zēng)長的(dí)過程，但是(shì)實際的PCR擴增(zēng)曲(qū)綫(xiàn)並不(bù)是(shì)標(biāo)準的(dí)指數(shù)曲綫(xiàn)，而是(shì)S形曲(qū)綫(xiàn)。

　　這(zhè)是(shì)因為隨(suí)著PCR循環的(dí)增多，擴(kuò)增(zēng)規模(mó)迅(xùn)速(sù)增大(dà)，Taq酶，dNTP，引物，甚至DNA模(mó)板(bǎn)等各(gè)種PCR要(yào)素逐漸不敷(fū)需求，PCR的(dí)效(xiào)率越(yuè)來越低(dī)，產物增長的速度就(jiù)逐漸(jiàn)減緩(huǎn)。當所有的Taq酶都(dū)被飽(bǎo)和以後，PCR就進入了平台期。由於(yú)各種環境因(yīn)素(sù)的復雜相(xiāng)互作用(yòng)，不(bù)同的(dí)PCR反應(yīng)體係進入(rù)平台期的時(shí)機和(hé)平台期(qī)的(dí)高低都有(yǒu)很大(dà)變化(huà)，難以(yǐ)精(jīng)確控(kòng)製。所以(yǐ)，即使(shǐ)是96次PCR重(zhòng)復實驗，各(gè)種條件基本*，所得結果有很(hěn)大差異，所(suǒ)以(yǐ)在(zài)實(shí)驗過(guò)程中我們不能根據(jù)zui終PCR產物(wù)的量直(zhí)接計算出起始DNA拷貝數。

　　熒光(guāng)定量(liáng)PCR的(dí)方(fāng)法(fǎ)：

　　熒光(guāng)定(dìng)量PCR所(suǒ)使用的熒(yíng)光(guāng)化學(xué)可(kě)分為兩(liǎng)種(zhǒng)：熒光探(tàn)針(zhēn)和熒(yíng)光染料。而熒(yíng)光定量(liáng) PCR 的方法相應(yīng)的可(kě)分(fēn)為特異類(lèi)和(hé)非特異(yì)類(lèi)兩類(lèi)，特(tè)異(yì)性檢(jiǎn)測(cè)方(fāng)法(fǎ)是(shì)在(zài)PCR反應(yīng)中(zhōng)利用標記(jì)熒光染(rǎn)料的基(jī)因(yīn)特(tè)異寡(guǎ)核苷酸探(tàn)針來(lái)檢(jiǎn)測產物(wù)；而非(fēi)特異(yì)性(xìng)檢測(cè)方法(fǎ)是在在(zài)PCR反應體係(xì)中，加入(rù)過(guò)量熒光染料(liào)，熒光染(rǎn)料(liào)特(tè)異(yì)性地摻(chān)入DNA雙(shuāng)鏈後，發(fā)射出熒光(guāng)信號。前者由(yóu)於增加了(liǎo)探(tàn)針的(dí)識別步(bù)驟，特異(yì)性更高，但(dàn)後(hòu)者則(zé)簡便(biàn)易行。

　　熒光定量PCRzui常(cháng)用(yòng)的(dí)方法(fǎ)是DNA結(jié)合(hé)染料SYBR GreenⅠ的非特異性(xìng)方(fāng)法和(hé)Taqman水解探針的(dí)特(tè)異性方法，在這(zhè)裏主要介(jiè)紹這2種(zhǒng)方(fāng)法(fǎ)，其它(tā)方法(fǎ)請(qǐng)參考其(qí)它(tā)熒(yíng)光(guāng)定量PCR資(zī)料(liào)。

　　1，非特(tè)異(yì)性(xìng)SYBR Green I染料(liào)法(fǎ)

　　SYBR Green I是一(yī)種(zhǒng)結合(hé)於(yú)所有dsDNA雙螺旋小(xiǎo)溝區(qū)域(yù)的具(jù)有(yǒu)綠色(sè)激發波(bō)長(cháng)的染(rǎn)料(liào)（結合示(shì)意(yì)圖），在遊離狀態下，SYBR Green I發出微弱(ruò)的熒(yíng)光(guāng)，但一(yī)旦與(yǔ)雙(shuāng)鏈(liàn)DNA結合後(hòu)，熒(yíng)光大大(dà)增強(qiáng)（作(zuò)用(yòng)機理(lǐ)圖(tú)）。因此(cǐ)，SYBR Green I的熒(yíng)光信(xìn)號(hào)強度與雙鏈(liàn)DNA的數(shù)量相(xiāng)關，可以根據熒光(guāng)信號(hào)檢(jiǎn)測出PCR體係存(cún)在的(dí)雙(shuāng)鏈(liàn)DNA數量(liáng)。

　　2，特異性Taqman水(shuǐ)解探針法

　　Taqman熒光定量技(jì)術是以Taqman熒光探針為(wéi)基(jī)礎，Taqman熒光(guāng)探針(zhēn)為一寡核(hé)苷酸，兩(liǎng)端(duān)分別標記(jì)一個熒光(guāng)發(fā)射基團和一(yī)個熒(yíng)光淬(cuì)滅基團(tuán)。探(tàn)針(zhēn)完(wán)整時，發(fā)射基團發射(shè)的熒光(guāng)信(xìn)號(hào)被淬滅(miè)基(jī)團吸收(shōu)；

　　PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的(dí)5’－3’外(wài)切酶活性(xìng)將探針酶切降解，使熒(yíng)光發射基(jī)團和熒光淬(cuì)滅基團分離(lí)，從(cóng)而(ér)熒光監測係統可(kě)接收(shōu)到(dào)熒光信號，即(jí)每擴增一條DNA鏈，就有(yǒu)一個(gè)熒(yíng)光(guāng)分(fēn)子(zǐ)形(xíng)成，實(shí)現(xiàn)了熒光(guāng)信號(hào)的(dí)累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。從(cóng)而(ér)實現定量（如(rú)下(xià)圖）。常用(yòng)的(dí)熒(yíng)光(guāng)基(jī)團(tuán)是FAM, TET, VIC, HEX。