第三(sān)章 蛋(dàn)白(bái)定(dìng)量

                               第三章 蛋(dàn)白定(dìng)量(liáng)

 

       目前常用比色(sè)法測定樣(yàng)品蛋白(bái)的(dí)含(hán)量：Bradford 法(fǎ)（考馬斯(sī)亮(liàng)藍法），Lowry 法（Folin-酚(fēn)試(shì)劑法）， BCA法等
。但(dàn)各有(yǒu)優缺(quē)點，大(dà)家可(kě)以根據具體(tǐ)情況(kuàng)選取(qǔ)
。按(àn)相(xiāng)應蛋白質定(dìng)量試(shì)劑(jì)盒操作(zuò)說明(míng)操作(zuò)，測定樣品濃度(dù)
。

       收集(jí)完(wán)蛋白樣(yàng)品後，為確保每(měi)個蛋(dàn)白樣(yàng)品的(dí)上樣量(liáng)一致，需(xū)要(yào)測定(dìng)每個蛋白樣品(pǐn)的蛋白濃度
。根據(jù)所(suǒ)使用的裂解(jiě)液(yè)的不同(tóng)，需(xū)要(yào)采用適(shì)當(dāng)的(dí)蛋白(bái)濃度(dù)測定方法
。因為(wéi)不(bù)同(tóng)的蛋白濃度(dù)測定方法對於一(yī)些去垢劑和還原劑(jì)等的兼容性差別(bié)很(hěn)大(dà)，大(dà)家(jiā)可以根(gēn)據具體情況(kuàng)選取
。

 Bradford 法(fǎ)（考馬斯亮(liàng)藍(lán)法）:

      考馬(mǎ)斯(sī)亮藍 G-250 有紅(hóng)，藍兩(liǎng)種(zhǒng)不同(tóng)顏色(sè)的(dí)形式，在一定濃度(dù)的乙(yǐ)醇和(hé)酸性條(tiáo)件下，可配成(chéng)淡紅色的(dí)溶液(yè)，與(yǔ)蛋(dàn)白(bái)結合後形(xíng)成藍(lán)色化合物(wù)，該化合(hé)物(wù)在 595 nm 處(chǔ)有zui大(dà)吸(xī)收值(zhí)，化合(hé)物顏色深(shēn)淺與(yǔ)蛋白(bái)的(dí)濃(nóng)度(dù)高低(dī)成正(zhèng)比
。

      該法操作(zuò)簡(jiǎn)便迅(xùn)速，消(xiāo)耗(hào)樣品量少，但(dàn)不(bù)同蛋(dàn)白質(zhì)之間差(chà)異(yì)大，且(qiě)標(biāo)準曲(qū)綫綫(xiàn)性(xìng)差
。高(gāo)濃(nóng)度的 Tris，EDTA，尿素(sù)，甘(gān)油(yóu)，蔗糖，丙(bǐng)酮，硫(liú)酸銨(ǎn)和去汙劑(jì)對(duì)測(cè)定有幹(gān)擾
。緩衝(chōng)液濃度過高時，改變測定液 pH 值(zhí)會影響(xiǎng)顯(xiǎn)色
。

Lowry 法（Folin-酚試劑法）:

      林-酚(fēn)試(shì)劑(jì)（Folin-phenol reagent）的顯(xiǎn)色(sè)原理(lǐ)是：首先在(zài)鹼(jiǎn)性(xìng)條件下(xià)蛋白質與(yǔ)銅作(zuò)用(yòng)生成蛋白質(zhì)-銅復合物，該(gāi)復合物隨之將磷(lín)鉬酸-磷鎢酸(suān)還(huán)原成藍色復合(hé)物
。在(zài)一(yī)定條(tiáo)件(jiàn)下，藍色強度與(yǔ)蛋(dàn)白(bái)質量成正比，蛋白質(zhì)濃度範圍約在 25～250 μg/mL
。

     雖(suī)然該法是測(cè)定蛋(dàn)白質濃(nóng)度應用(yòng)zui廣(guǎng)泛的方法之一(yī)，但其(qí)缺點也(yě)很明(míng)顯(xiǎn)，專一(yī)性(xìng)較差，幹(gān)擾(rǎo)物質多（如Tris 緩衝(chōng)劑，蔗糖，硫酸銨，巰(qiú)基(jī)化(huà)物，酚(fēn)類(lèi)，檸檬酸等），標(biāo)準(zhǔn)曲綫(xiàn)的(dí)直(zhí)綫(xiàn)關係不特(tè)別嚴格(gé)
。因此(cǐ)在(zài)其(qí)應用(yòng)過(guò)程中有很(hěn)多新的(dí)修正
。

BCA 法(fǎ)（二(èr)喹啉甲(jiǎ)酸法(fǎ)）:

      二喹啉(lán)甲酸(Bicinchoninic acid，BCA )法(fǎ)是(shì)Lowry測定法的(dí)一種改進(jìn)方法，是(shì)近(jìn)來(lái)廣為(wéi)應(yīng)用的蛋(dàn)白定量方法(fǎ)
。其原理與(yǔ)Lowery法蛋白定量相(xiāng)似(sì)，即(jí)在(zài)鹼性(xìng)條件下蛋白質分(fēn)子中(zhōng)的(dí)肽鍵能與Cu2+絡(luò)合(hé)生成(chéng)絡合物，同(tóng)時將Cu2+還原成(chéng)Cu+
。二喹啉(lán)甲(jiǎ)酸及其鈉鹽是一種溶於水的化(huà)合物(wù)，在(zài)鹼性(xìng)條(tiáo)件(jiàn)下，可(kě)以和Cu+結合形(xíng)成穩定的紫藍(lán)色復合物(wù)，在(zài) 562 nm處有高(gāo)的光吸收(shōu)值(zhí)，並且(qiě)化合物顏色的深淺與(yǔ)蛋(dàn)白質(zhì)濃(nóng)度(dù)成(chéng)正比(bǐ)，據此可(kě)測(cè)定蛋(dàn)白質濃度(dù)
。

與(yǔ) Lowery 法相(xiāng)比，BCA 蛋白(bái)測(cè)定(dìng)方法操作更簡單(dān)，試劑及其形成(chéng)的(dí)顏(yán)色(sè)復合物(wù)穩定性更好，幾(jī)乎(hū)沒(méi)有(yǒu)幹(gān)擾物(wù)質(zhì)的影(yǐng)響(xiǎng)，靈敏(mǐn)度高（微量(liáng)檢測可達(dá)到(dào) 0.5 μg/ml），應(yīng)用更加靈(líng)活
。與 Bradford 法(fǎ)相比(bǐ)，BCA 法的(dí)顯(xiǎn)著優點(diǎn)是(shì)不受去(qù)垢劑(jì)的(dí)影(yǐng)響
。

      BCA 法(fǎ)與(yǔ) Lowry 法都(dū)容易受到蛋白(bái)質之(zhī)間以及去(qù)汙劑的(dí)幹擾
。Bradford 法敏(mǐn)感度(dù)zui高(gāo)，且(qiě)與一係(xì)列(liè)幹擾(rǎo) Lowry，BCA 反應的還原劑（如 DTT，巰(qiú)基(jī)乙醇(chún)）相容
。但是對(duì)於去汙劑依(yī)然(rán)是(shì)敏(mǐn)感的(dí)，其zui主(zhǔ)要的缺點(diǎn)是(shì)不同的(dí)標(biāo)準品會(huì)導致(zhì)同一樣品(pǐn)的(dí)結果(guǒ)差(chà)異(yì)較(jiào)大(dà)，無可比性
。