熒光定量(liáng)PCRZ常用的方法

     熒光定量PCR檢測zui常(cháng)用的方(fāng)法：
    理(lǐ)論(lùn)上PCR是(shì)一個(gè)指(zhǐ)數增長的(dí)過(guò)程，但是實際的PCR擴增曲綫並(bìng)不(bù)是(shì)標準的(dí)指數曲(qū)綫，而(ér)是(shì)S形(xíng)曲(qū)綫。
    這(zhè)是因(yīn)為隨(suí)著(zhuó)PCR循環(huán)的(dí)增(zēng)多(duō)，擴增規模迅(xùn)速(sù)增(zēng)大，Taq酶(méi)
，dNTP
，引(yǐn)物(wù)，甚(shèn)至(zhì)DNA模(mó)板等各(gè)種PCR要素逐(zhú)漸(jiàn)不(bù)敷(fū)需求，PCR的(dí)效率越來越低，產物(wù)增長(cháng)的(dí)速(sù)度就逐(zhú)漸(jiàn)減緩(huǎn)。當所有的(dí)Taq酶(méi)都被飽和(hé)以後，PCR就進(jìn)入了平(píng)台期。由(yóu)於各(gè)種環境因(yīn)素(sù)的(dí)復雜相互(hù)作(zuò)用，不(bù)同的(dí)PCR反(fǎn)應(yīng)體(tǐ)係進(jìn)入(rù)平台期的(dí)時機和平台期的高低(dī)都有(yǒu)很大變化，難(nán)以控製。所以，即(jí)使是(shì)96次(cì)PCR重(zhòng)復(fù)實(shí)驗，各(gè)種(zhǒng)條件基(jī)本一致，所(suǒ)得(dé)結果有很大(dà)差異，所以在實驗過程(chéng)中(zhōng)我們不能(néng)根據zui終PCR產物(wù)的量(liáng)直接計(jì)算出(chū)起(qǐ)始DNA拷貝(bèi)數。
    熒光定(dìng)量PCR檢測的方(fāng)法：
    熒光定(dìng)量(liáng)PCR檢(jiǎn)測所(suǒ)使用(yòng)的熒(yíng)光(guāng)化學(xué)可(kě)分為兩種(zhǒng)：熒光(guāng)探(tàn)針和熒光(guāng)染(rǎn)料。而(ér)熒(yíng)光(guāng)定(dìng)量 PCR 的方法相應的可分(fēn)為特異類(lèi)和(hé)非特異類(lèi)兩類，特(tè)異性(xìng)檢(jiǎn)測(cè)方法是在(zài)PCR反應中利用標(biāo)記熒光染(rǎn)料的(dí)基因特異(yì)寡(guǎ)核苷(gān)酸(suān)探針來(lái)檢(jiǎn)測產(chǎn)物
；而非特(tè)異性(xìng)檢(jiǎn)測方法是在在PCR反應體係中(zhōng)，加(jiā)入過量(liáng)熒光染料，熒(yíng)光(guāng)染(rǎn)料特異(yì)性(xìng)地摻入DNA雙鏈(liàn)後，發(fā)射(shè)出(chū)熒光信(xìn)號。前(qián)者(zhě)由於(yú)增(zēng)加(jiā)了探針(zhēn)的識別(bié)步(bù)驟，特異性更(gēng)高(gāo)，但(dàn)後者(zhě)則簡便易行。
    熒(yíng)光(guāng)定(dìng)量PCRzui常用的方法是DNA結(jié)合(hé)染料SYBR GreenⅠ的非(fēi)特(tè)異性方(fāng)法和(hé)Taqman水(shuǐ)解(jiě)探針的(dí)特異(yì)性(xìng)方法，在這(zhè)裏(lǐ)主要介(jiè)紹這(zhè)2種方(fāng)法，其它(tā)方法(fǎ)請參考其(qí)它熒光定(dìng)量(liáng)PCR資料。
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，非特(tè)異(yì)性(xìng)SYBR Green I染料(liào)法
    SYBR Green I是一(yī)種結合於所有dsDNA雙螺旋(xuán)小溝區(qū)域的具有綠色激(jī)發波(bō)長的染料(liào)（結(jié)合示意圖），在遊離狀態下(xià)，SYBR Green I發出微弱的熒(yíng)光，但一旦與雙鏈DNA結合後，熒(yíng)光(guāng)大大增(zēng)強（作用(yòng)機(jī)理(lǐ)圖）。因此(cǐ)，SYBR Green I的熒光(guāng)信(xìn)號強度與(yǔ)雙鏈DNA的數量相關，可以根據(jù)熒光信(xìn)號(hào)檢測出PCR體(tǐ)係(xì)存在的(dí)雙(shuāng)鏈DNA數(shù)量。
    2
，特(tè)異(yì)性Taqman水解(jiě)探針(zhēn)法(fǎ)
    Taqman熒光(guāng)定(dìng)量(liáng)技(jì)術(shù)是(shì)以(yǐ)Taqman熒(yíng)光探(tàn)針(zhēn)為基(jī)礎(chǔ)，Taqman熒(yíng)光(guāng)探針為一(yī)寡核苷(gān)酸，兩端(duān)分別標記一個熒光(guāng)發射基團和(hé)一個(gè)熒(yíng)光淬滅基團。探針完整(zhěng)時(shí)，發(fā)射基團發(fā)射的(dí)熒(yíng)光信號(hào)被(bèi)淬(cuì)滅(miè)基(jī)團(tuán)吸收(shōu)
；
    PCR擴增時(shí)，Taq酶(méi)的5’－3’外(wài)切(qiē)酶(méi)活性將探針(zhēn)酶切(qiē)降解，使熒光(guāng)發(fā)射(shè)基團(tuán)和(hé)熒光(guāng)淬(cuì)滅基團分離(lí)，從(cóng)而熒(yíng)光監(jiān)測係統可接(jiē)收到(dào)熒(yíng)光信(xìn)號(hào)，即每擴增(zēng)一(yī)條DNA鏈(liàn)，就有(yǒu)一個熒光分(fēn)子形成(chéng)，實(shí)現了熒(yíng)光信(xìn)號(hào)的(dí)累積(jī)與PCR產(chǎn)物形成(chéng)*同步(bù)。從而(ér)實(shí)現定(dìng)量(liáng)（如(rú)下(xià)圖(tú)）。常(cháng)用(yòng)的熒光基團(tuán)是(shì)FAM, TET, VIC, HEX。