TA克(kè)隆(lóng)實驗原理　

    TA克隆實驗(yàn)原理(lǐ)
    TA克隆(lóng)是(shì)利(lì)用耐熱聚合(hé)酶，如(rú)Taq聚合酶，Tfl，Tth等具有末端(duān)轉(zhuǎn)移酶(méi)活性，而(ér)不(bù)具(jù)有3 一(yī)5外切(qiē)酶的(dí)校準(zhǔn)活(huó)性(xìng)，即在(zài)PCR產物(wù)的(dí)兩(liǎng)個3 末端(duān)加上未配對(duì)的單(dān)一A凸出(chū)尾 ，質粒(lì)載體(tǐ)提供(gōng)綫性(xìng)3末端單一(yī)的(dí)T凸出(chū)尾，使該載(zǎi)體能夠(gòu)直接與PCR產(chǎn)物(wù)連(lián)接(jiē)。TA克隆(lóng)技(jì)術比其(qí)它PCR克(kè)隆方(fāng)法有(yǒu)更(gēng)高(gāo)的(dí)重組(zǔ)效率。
    TA克隆隻需(xū)4個步驟(zhòu)：①擴增目(mù)的PCR產(chǎn)物；②製(zhì)備(bèi)T克(kè)隆載(zǎi)體；③PCR產物直(zhí)接(jiē)克隆至(zhì)T載(zǎi)體(tǐ)上④轉(zhuǎn)化(huà)並(bìng)篩選重(zhòng)組子。
    TA克隆實驗步(bù)驟(zhòu)
    （1）擴增後(hòu)的(dí)PCR產(chǎn)物與T載體的(dí)連(lián)接
    取1隻無菌(jūn)Ep管(guǎn)，用微(wēi)量進(jìn)樣(yàng)器(qì)按下(xià)列(liè)順(shùn)序(xù)加(jiā)入各(gè)成(chéng)分(fēn)。
    10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul
    PCR產(chǎn)物約(yuē)0.3 pmol
    T載(zǎi)體約(yuē)0.03pmol
    T4 DNA Ligase 1ul
    ddH2O 加至(zhì) 25ul
    *1 DNA的摩爾數(shù)應控(kòng)製在載(zǎi)體DNA摩爾(ěr)數的(dí)3－10倍(bèi)。
    *2 相(xiāng)同(tóng)末端(duān)的(dí)載(zǎi)體與DNA進行連(lián)接時(shí)，應(yīng)首(shǒu)先將載體(tǐ)進行(háng)去磷酸化處理(lǐ)，以防(fáng)止其自身環(huán)化。
    （2）蓋好(hǎo)蓋子，用手(shǒu)指(zhǐ)輕(qīng)彈Ep管數(shù)次(cì)，並於(yú)台(tái)式離(lí)心機(jī)離心2s 以(yǐ)集(jí)中溶液。
    （3）將反(fǎn)應(yīng)管放(fàng)入(rù)4℃金屬浴中(zhōng)反(fǎn)應20h。
    （4）取(qǔ)出(chū)約(yuē)2ul的(dí)DNA連(lián)接(jiē)液進行瓊脂糖(táng)凝膠電(diàn)泳(yǒng)，鑒定連(lián)接結(jié)果(guǒ)，與未經連(lián)接的(dí)質(zhì)粒(lì)DNA和酶切DNA一(yī)同(tóng)作(zuò)電(diàn)泳(yǒng)。
    （5）用0.1×TE將(jiāng)連接混合物稀釋至50ul，使用(yòng)10ul轉(zhuǎn)化(huà)大(dà)腸(cháng)杆(gān)菌(jūn)感受態(tài)細(xì)胞(bāo)。
    （6）通過(guò)Amp抗性(xìng)來篩選轉(zhuǎn)化子(zǐ)，轉化子(zǐ)擴增(zēng)後(hòu)，可(kě)將轉(zhuǎn)化的(dí)質粒提取出，進行電泳，酶(méi)切(qiē)等(děng)進一步鑒(jiàn)定。