siRNA幹擾(rǎo)檢測服務

原理：RNA幹擾 (RNA interference, RNAi)技術，是將與內(nèi)源mRNA 編(biān)碼區(qū)同(tóng)源的小片段(duàn)(19 -23bp)外(wài)源雙(shuāng)鏈(liàn) RNA(siRNA)導入細胞中(zhōng)，引(yǐn)發細(xì)胞中相(xiāng)應mRNA 高效特(tè)異(yì)性降解，從而導致(zhì)特定基因表達(dá)沉默(mò)(knock down)的一種實(shí)驗(yàn)技(jì)術，其中(zhōng)通過(guò)構建表達載體表(biǎo)達(dá)siRNA是多種(zhǒng)siRNA製(zhì)備(bèi)方(fāng)法中*有(yǒu)可能進行(háng)長(cháng)期基因(yīn)沉默研(yán)究的方(fāng)法，siRNA 載體(tǐ)可(kě)以(yǐ)在(zài)細胞內(nèi)直接(jiē)轉錄(lù)出shrna ，其幹擾(rǎo)效果等同(tóng)於siRNA ，而且(qiě)能夠(gòu)解(jiě)決 siRNA幹擾時間短的缺(quē)點(diǎn)。您隻需提(tí)供需幹擾(rǎo)基(jī)因(yīn)的(dí)詳細信息，包括(kuò)基(jī)因的(dí) mRNA 序(xù)列(liè)，Genbank Accession No. 和(hé)所(suǒ)屬物種(zhǒng)，本(běn)公(gōng)司(sī)負責設(shè)計3條(tiáo)針對目的mRNA的(dí)siRNA 靶(bǎ)序列(liè)，在短時間內(nèi)構建(jiàn)三個(gè)可(kě)用於目(mù)的(dí)mRNA幹(gān)擾實驗的siRNA 載(zǎi)體(tǐ)並為您進行(háng)後(hòu)續的(dí)幹(gān)擾(rǎo)實驗研(yán)究。

實驗(yàn)流程(chéng)

◇ 選擇(zé)siRNA表達載體 通(tōng)過人工合(hé)成(chéng)基(jī)因的(dí)方法將該序(xù)列(liè)克隆至(zhì)Clontech公司的(dí)RNAi-Ready pSIREN係(xì)列表(biǎo)達(dá)載體(tǐ)中(zhōng)，該係列(liè)表達(dá)載(zǎi)體帶有(yǒu)Pol III(U6)啟動(dòng)子(zǐ)，具有轉(zhuǎn)染(rǎn)效(xiào)率(shuài)高(gāo)，操作簡(jiǎn)單(dān)，rna沉(chén)默效(xiào)果易(yì)於檢(jiǎn)測(cè)等特點，客(kè)戶(hù)可根(gēn)據需要進行選擇。

◇ 設計(jì)siRNA靶序(xù)列

◇ 根(gēn)據(jù)客戶(hù)提交(jiāo)的(dí)目的mRNA序(xù)列(liè)，設(shè)計(jì)3條(tiáo)RNA幹擾靶序(xù)列(liè)，靶序(xù)列一般(bān)為(wéi)19-21nt 長。

◇ 對(duì)於每條選定(dìng)的(dí)siRNA 靶序(xù)列，設計(jì) siRNA 正義鏈(liàn)和反義鏈(liàn)，以 loop(9nt or 10nt) 相連(lián)，形成穩(wěn)定的發卡RNA，稱(chēng)為 shRNA(short hairpin RNA)。

◇ 合成模板 合(hé)成(chéng)每條(tiáo)編碼(mǎ) shRNA的(dí)DNA 模板，並連接到 siRNA 載(zǎi)體相應(yīng)的(dí)多克(kè)隆(lóng)位(wèi)點之(zhī)間。連接產物(wù)轉(zhuǎn)化DH5α大腸杆菌。

◇ 抽(chōu)提(tí)陽(yáng)性(xìng)克隆質粒(lì) 公司(sī)試(shì)劑盒抽(chōu)提(tí)陽性克隆載體並(bìng)定量。

◇ 轉染細胞(bāo) 質粒直接轉染或(huò)通過病毒包裝(zhuāng)後(hòu)轉(zhuǎn)染細胞(bāo)，並對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進行陽性鑒定和轉(zhuǎn)代細胞株(zhū)的(dí)培養。

◇ 幹擾效(xiào)果(guǒ)檢測

◇ 基因水平上(shàng)檢測 提取(qǔ)RNA，反轉錄，Realtime PCR檢(jiǎn)測(cè)幹(gān)擾(rǎo)效果(guǒ)(客戶自備細胞(bāo)係)。

◇ 蛋白水(shuǐ)平(píng)上(shàng)檢(jiǎn)測 Western Blot檢(jiǎn)測蛋白水(shuǐ)平(píng)幹擾(rǎo)效果(客(kè)戶自備一(yī)抗)。

服務(wù)周期(qī)及價(jià)格(gé)

服務(wù)說明(míng)

◇ siRNA服(fú)務(wù)需(xū)客戶與我們共(gòng)同(tóng)討論(lùn)實驗方(fāng)案，並提(tí)供(gōng)靶基(jī)因名(míng)稱(chēng)，序列(liè)或GeneBank ID和(hé)希望(wàng)插(chā)入載體的名稱(chēng)等，免(miǎn)費為您設計(jì)siRNA序(xù)列。

◇ 由於(yú)構(gòu)建(jiàn)的siRNA表達載(zǎi)體中插入的(dí)片(piàn)段可以形成hairpin結構，因此可(kě)能會影響(xiǎng)測序(xù)。如(rú)果我們對質(zhì)粒(lì)測序(xù)結(jié)果不理想(xiǎng)時，將對由質粒(lì)擴增(zēng)得到的(dí)PCR產物進行測序(xù)。

◇ 開(kāi)始實驗時公司和客(kè)戶(hù)簽訂詳(xiáng)細的(dí)實驗(yàn)技術服務合同(tóng)，保(bǎo)密合同，客戶(hù)需(xū)預(yù)付(fù)合同金額(é)的(dí)50%作為預付款。

提(tí)供結(jié)果(guǒ)

實(shí)驗報(bào)告(gào)包(bāo)括(kuò)：siRNA序列，構建載體(tǐ)的測序(xù)報告(gào)，熒光定(dìng)量PCR檢測(cè)報告(gào)，Western Blot圖片及全部實驗數據和(hé)詳細(xì)的(dí)實(shí)驗(yàn)步驟。