第(dì)六章(zhāng) 蛋(dàn)白轉膜

                                第六章 蛋白轉(zhuǎn)膜(mó)

6.1  轉膜的定義

將電(diàn)泳後分離(lí)的蛋(dàn)白(bái)質從凝膠(jiāo)中轉移到固(gù)相(xiāng)載(zǎi)體（例如(rú) NC 膜）上，通常(cháng)有(yǒu)兩種方法：毛(máo)細管印跡法(fǎ)和電泳印跡(jì)法(fǎ)。常(cháng)用(yòng)的(dí)電泳轉(zhuǎn)移方法有濕(shī)轉和半(bàn)幹(gān)轉(zhuǎn)。兩(liǎng)者(zhě)的(dí)原(yuán)理*相同，隻是(shì)用(yòng)於(yú)固定(dìng)膠/膜疊層和(hé)施加電場的機械裝置(zhì)不同(tóng)。前者(zhě)操(cāo)作容(róng)易，轉移(yí)效率(shuài)高(gāo)；而後者適用於(yú)大膠(jiāo)的蛋(dàn)白(bái)轉移，所用(yòng)緩衝液(yè)少。

6.2  轉(zhuǎn)移膜的(dí)選擇(zé)

    雜(zá)交膜的(dí)選擇是(shì)決(jué)定 Western blot 成敗(bài)的重要(yào)環節。應根據雜(zá)交方案，被轉(zhuǎn)移蛋(dàn)白的(dí)特(tè)性以及(jí)分(fēn)子大(dà)小(xiǎo)等因(yīn)素，選擇合(hé)適材質(zhì)，孔徑和規(guī)格(gé)的(dí)雜交膜。用於(yú) Western blot 的膜主要(yào)有兩(liǎng)種(zhǒng)：硝酸纖(xiān)維素膜（NC） 和PVDF 膜。NC 膜是蛋白(bái)印跡實驗的(dí)標(biāo)準(zhǔn)固相支(zhī)持物，在低(dī)離子轉(zhuǎn)移緩(huǎn)衝(chōng)液的(dí)環境(jìng)下，大多(duō)數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與(yǔ)膜發生疏水作(zuò)用(yòng)而(ér)高親和力(lì)的結(jié)合(hé)在一起，但(dàn)在(zài)非(fēi)離子型(xíng)的去汙(wū)劑作用下(xià)，結合的(dí)蛋(dàn)白(bái)還可以(yǐ)被(bèi)洗脫下來(lái)。根(gēn)據(jù)被轉(zhuǎn)移(yí)的蛋白(bái)分子(zǐ)量大(dà)小，選擇不同(tóng)孔徑的(dí) NC 膜。因(yīn)為隨(suí)著(zhuó)膜孔(kǒng)徑(jìng)的不斷減(jiǎn)小，膜(mó)對(duì)低(dī)分(fēn)子量蛋(dàn)白(bái)的(dí)結合(hé)就越(yuè)牢固。通常用 0.45 μm 和 0.2 μm 兩(liǎng)種規格的 NC 膜。大於(yú) 20 kD 的(dí)蛋白可用 0.45 μm 的膜(mó)，小於 20 kD 的蛋(dàn)白就要用 0.2 μm 的膜了，如(rú)用(yòng) 0.45 μm 的膜(mó)就(jiù)會發生“Blowthrough"的(dí)現(xiàn)象。PVDF 膜靈敏度(dù)，分(fēn)辨率和蛋白親(qīn)和(hé)力比常(cháng)規的(dí)膜(mó)要(yào)高(gāo)，非(fēi)常適(shì)合(hé)於低分子量蛋白的(dí)檢測。但(dàn) PVDF 膜在(zài)使(shǐ)用之前必(bì)需用純甲(jiǎ)醇浸(jìn)泡飽和(hé)1-5秒鐘(zhōng)。

zui 常 用 於 Western Blot 的轉移(yí)膜主要(yào)是(shì) 硝(xiāo) 酸 纖(xiān) 維 素 （ Nitrocellulose, NC ）膜和(hé)聚偏二氟乙(yǐ)烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜(mó)，此外也有(yǒu)用尼(ní)龍(lóng)膜(mó)，DEAE 纖維素(sù)膜(mó)做蛋白(bái)印跡(jì)。尼(ní)龍膜(mó)和 NC 膜(mó)的特(tè)點相似,主要用於(yú)核酸(suān)雜(zá)交。

    硝酸(suān)纖維素（nitrocellulose, NC）膜：NC 與蛋(dàn)白質(zhì)靠(kào)疏水(shuǐ)作(zuò)用結合，無(wú)需預先活化，對蛋白質的(dí)活性(xìng)影響小(xiǎo)；非特異性(xìng)本底(dǐ)顯色淺；價格低廉，使(shǐ)用方(fāng)便(biàn)。但(dàn)結合(hé)在 NC 上(shàng)的(dí)小分子(zǐ)蛋白(bái)質在洗(xǐ)滌時易丟(diū)失(shī)； NC韌性較差，易損(sǔn)壞。

    聚(jù)偏(piān)二(èr)氟乙(yǐ)烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：與蛋(dàn)白質親和(hé)力(lì)高，用前需在甲(jiǎ)醇中浸泡(pào)，以(yǐ)活(huó)化膜(mó)上(shàng)的(dí)正電(diàn)基(jī)團，使其更(gēng)容易(yì)與帶負電荷蛋白結合。

膜的(dí)選(xuǎn)擇主要根據：

膜(mó)與目(mù)的(dí)蛋(dàn)白分子(zǐ)的結合能力（也(yě)就(jiù)是單位麵(miàn)積(jī)的(dí)膜能(néng)結(jié)合蛋白(bái)的載量(liáng)），以(yǐ)及膜的孔(kǒng)徑（也就是(shì)攔截蛋(dàn)白的大(dà)小）；

不影響後續(xù)的(dí)顯色檢測(cè)（也(yě)就是(shì)適和(hé)用於(yú)所選的顯(xiǎn)色方法，信(xìn)噪比好(hǎo)）；

如果後(hòu)繼實驗有(yǒu)其他(tā)要(yào)求，比如(rú)要(yào)做蛋白測(cè)序或(huò)者質譜(pǔ)分(fēn)析，還要根據不同目的來挑選(xuǎn)不同(tóng)的(dí)轉(zhuǎn)移膜。



                                                      

6.3  轉膜步驟（以槽式濕(shī)轉(zhuǎn)為例(lì)）

1.  將(jiāng)膠(jiāo)浸於(yú)轉(zhuǎn)移(yí)緩(huǎn)衝液(yè)中平衡 10 min。

注意(yì)：如(rú)檢測小分(fēn)子蛋(dàn)白(bái)，可省略此步，因小(xiǎo)分子蛋(dàn)白(bái)容易擴(kuò)散(sàn)出膠。

2.  依(yī)據(jù)膠(jiāo)的大(dà)小剪取膜和(hé)濾(lǜ)紙 6 片(piàn)，放(fàng)入(rù)轉(zhuǎn)移緩衝(chōng)液中平衡(héng) 10 min。如用(yòng) PVDF 膜(mó)需用純甲醇(chún)浸泡(pào)飽和 3-5秒(miǎo)鐘。

3.  裝(zhuāng)配(pèi)轉移(yí)三明治(zhì)：海(hǎi)綿(mián)/3 層濾紙/膠/膜/3 層濾紙(zhǐ)/海綿，每層放好(hǎo)後，用(yòng)試管(guǎn)趕(gǎn)去(qù)氣泡。

    切(qiē)記：膠放(fàng)於(yú)負(fù)極麵（黑色麵）。

4.  將轉(zhuǎn)移(yí)槽置於冰(bīng)浴中(zhōng)，放(fàng)入三明(míng)治（黑(hēi)色麵(miàn)對(duì)黑色麵(miàn)），加轉移緩(huǎn)衝(chōng)液，插(chā)上電極，100 V，1 h（電流約為 0.3 A）。

注意(yì)：應(yīng)再(zài)次(cì)檢(jiǎn)查三(sān)明(míng)治(zhì)和電極是否裝(zhuāng)配正(zhèng)確，電(diàn)源(yuán)是(shì)否接通。


 5.  轉(zhuǎn)膜結束後(hòu)，切(qiē)斷電源(yuán)，取出雜(zá)交(jiāo)膜。

                                                                        

6.4  轉(zhuǎn)膜(mó)注意事(shì)項

1. 泡膜(mó)：轉(zhuǎn)膜之(zhī)前將海綿，膠，膜都(dū)用預(yù)冷的轉移 buffer 浸泡 20min；

a. 凝(níng)膠若是沒(méi)在(zài)預(yù)冷的(dí)轉膜 buffer 中(zhōng)浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝(níng)膠皺(zhòu)縮(suō)，導(dǎo)致出(chū)現轉移條帶變(biàn)形。

b. PVDF 膜具有(yǒu)疏水性，需(xū)用(yòng)甲(jiǎ)醇(chún)浸(jìn)泡。

2. 轉膜(mó)順序：陰極(jí)碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海(hǎi)綿+陽(yáng)極(jí)碳(tàn)板；

3. 轉(zhuǎn)膜條(tiáo)件(jiàn)：0.35 A/250 V/1 h/40 min/冰浴(yù)中(zhōng)進(jìn)行(háng)轉膜(mó)（轉膜過(guò)程產生大量(liáng)的熱，注(zhù)意(yì)冷卻）；

（具體(tǐ)轉膜(mó)時間(jiān)要(yào)根(gēn)據目的蛋白的(dí)大小而(ér)定；目的蛋白的分子量越大(dà)，需要的轉(zhuǎn)膜(mó)時間越(yuè)長，反之(zhī)則短(duǎn)。）

4. 其(qí)它注(zhù)意事(shì)項(xiàng)：

a. 避免直(zhí)接用手碰(pèng)雜交膜(mó)，使(shǐ)用鑷子。因(yīn)為手上的蛋白和(hé)油(yóu)脂(zhī)會(huì)影響轉膜(mó)效(xiào)率並會(huì)使膜髒掉。

b. 夾(jiā)好膜(mó)和(hé)凝膠後(hòu)，確(què)定(dìng)在(zài)凝膠(jiāo)/膜(mó)和(hé)濾(lǜ)紙之(zhī)間沒(méi)有氣泡(pào)存(cún)在，否(fǒu)則會(huì)導(dǎo)致(zhì)轉(zhuǎn)膜不(bù)*。

c. 保證膜和(hé)濾(lǜ)紙的(dí)大(dà)小(xiǎo)和(hé)凝膠*一(yī)樣，過大和(hé)過小(xiǎo)都(dū)會(huì)影響轉膜效(xiào)率(shuài)。

                      d. 雞來源的(dí)抗(kàng)體(tǐ)與(yǔ) PVDF 和尼龍(lóng)膜有較(jiào)強的(dí)結(jié)合能(néng)力，從而產生(shēng)較高(gāo)的(dí)背景(jǐng)，故如(rú)果選(xuǎn)擇(zé)雞來源的抗(kàng)體

6.5  轉膜後檢測(cè)（此步(bù)可以省(shěng)略）

   轉(zhuǎn)膜完畢(bì)後，立(lì)即(jí)把蛋白膜放置(zhì)到(dào)預(yù)先(xiān)準備好的 TBST（或 PBST）中(zhōng)漂(piāo)洗 1-2 分(fēn)鐘(zhōng)，以(yǐ)洗(xǐ)去膜上(shàng)的轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜(mó)的(dí)效(xiào)果可(kě)以觀察(chá)所(suǒ)使用(yòng)的預染(rǎn)蛋白質分子量標準(zhǔn)，通(tōng)常分(fēn)子(zǐ)量(liáng)zui大(dà)的 1-2 條帶(dài)較(jiào)難全部(bù)轉(zhuǎn)到膜上(shàng)。轉膜(mó)的(dí)效果(guǒ)也(yě)可(kě)以用麗(lì)春紅(hóng)染色液或(huò)硬度墨(mò)汁(zhī)染色液(yè)對(duì)膜進(jìn)行染色，以(yǐ)觀察(chá)實(shí)際的(dí)轉(zhuǎn)膜效果。也可(kě)以(yǐ)用考馬(mǎ)斯亮(liàng)藍快速(sù)染(rǎn)色(sè)液(yè)對完成轉膜的(dí) SDS-PAGE 膠進行染色(sè)，以觀察(chá)蛋白(bái)的殘留(liú)情(qíng)況。

a. 麗(lì)春紅(hóng)染(rǎn)色(sè)：蛋(dàn)白(bái)帶出(chū)現(xiàn)後，於(yú)室溫(wēn)用去離(lí)子(zǐ)水漂洗硝酸纖維(wéi)素(sù)濾(lǜ)膜(mó)，換(huàn)水幾(jī)次(cì)。

b. 印度墨汁(zhī)染(rǎn)色：隻(zhī)用(yòng)於放射(shè)性標記抗體或(huò)放射(shè)性(xìng)標(biāo)記 A 蛋(dàn)白探針的 Western 印跡過程。

印度(dù)墨汁不能(néng)和化(huà)學發光物(wù)合用，若是使用呈色(sè)反應的(dí)酶(méi)檢測法時(shí)，印(yìn)度墨(mò)汁的黑色會(huì)使凝膠難於拍(pāi)照。這時，可改用(yòng)其(qí)他(tā)檢測(cè)方法(fǎ)或換用(yòng)麗春(chūn)紅(hóng) S。

注意(yì)：從轉膜完畢後所有的(dí)步驟(zhòu)，一(yī)定(dìng)要(yào)注意膜的保濕，避(bì)免(miǎn)膜的幹(gān)燥，否(fǒu)則(zé)極易產(chǎn)生較高的背景。