第(dì)五章(zhāng) 蛋白電(diàn)泳(yǒng)

                                     第五章 蛋白(bái)電(diàn)泳(yǒng)




5.1  SDS-PAGE 基本原理(lǐ)

1. SDS-PAGE 是(shì)在蛋(dàn)白質(zhì)樣品中(zhōng)加入(rù) SDS 和含(hán)有(yǒu)巰(qiú)基(jī)乙醇(chún)的樣品(pǐn)處理液，SDS 是一種很強的(dí)陰離子(zǐ)表(biǎo)麵(miàn)活性(xìng)劑，它可(kě)以斷開分子(zǐ)內(nèi)和(hé)分(fēn)子間的氫鍵(jiàn)，破壞蛋白質(zhì)分(fēn)子(zǐ)的二(èr)級和三級(jí)結構(gòu)。

2.  強還原劑(jì)巰基乙醇（或二硫蘇糖醇(chún)，DTT）可以斷(duàn)開二(èr)硫鍵破(pò)壞蛋白質(zhì)的(dí)四(sì)級結構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成(chéng)單鏈分(fēn)子。解(jiě)聚後(hòu)的(dí)側(cè)鏈與(yǔ) SDS 充分(fēn)結(jié)合形(xíng)成帶(dài)負電荷的蛋(dàn)白質-SDS 復合(hé)物(wù)。

3.  蛋白(bái)質分子結合(hé) SDS 陰離子後(hòu)，所帶(dài)負電荷的量(liáng)遠遠超(chāo)過了它原(yuán)有的淨電(diàn)荷，從(cóng)而消除了(liǎo)不(bù)同種蛋白質之間(jiān)所(suǒ)帶(dài)淨(jìng)電荷(hé)的差異。蛋白質的電泳(yǒng)遷(qiān)移率主要(yào)決定(dìng)於(yú)亞基的相對(duì)分(fēn)子(zǐ)質量，而(ér)與其所帶電(diàn)荷的性質(zhì)無(wú)關。

5.2  PAGE：聚丙烯酰(xiān)胺(àn)凝膠

聚(jù)丙烯(xī)酰(xiān)胺(àn)凝(níng)膠(jiāo)(polyacrylamide gel)是(shì)由單體丙烯酰胺(àn)（acrylamide，簡(jiǎn)稱(chēng)Acr）和交聯(lián)劑（crosslinker)N,N’-亞甲(jiǎ)基(jī)雙丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，簡稱 Bis）在催(cuī)化劑（過硫(liú)酸胺(àn)或(huò)核(hé)黃(huáng)素(sù) AP）和加速劑（四甲(jiǎ)基(jī)乙(yǐ)二(èr)胺 TEMED）作用(yòng)下聚(jù)合交(jiāo)聯(lián)而(ér)成的(dí)三(sān)維網狀(zhuàng)結(jié)構(gòu)的凝(níng)膠。化學惰(duò)性強，具(jù)有一(yī)定(dìng)的機(jī)械強(qiáng)度(dù)和透明(míng)度。是良好的(dí)電泳(yǒng)介質(zhì)。聚丙烯酰(xiān)胺(àn)凝膠聚合(hé)機理(lǐ)是(shì)通(tōng)過提供氧(yǎng)遊離基（free radicals）的催化，使體係發生氧化(huà)還原(yuán)作用(catalyst-redox systems)來(lái)完成(chéng)的。催化體係主要有(yǒu)化(huà)學(xué)催化(huà)（AP-TEMED）和光化學催化(huà)（核黃素-TMTED）體(tǐ)係。

                                      

5.3 聚(jù)丙(bǐng)烯酰(xiān)胺凝膠分類(lèi)

   PAGE 分為(wéi)連續(xù)係統(tǒng)和(hé)不(bù)連續(xù)係(xì)統(tǒng)兩(liǎng)大類。連(lián)續(xù)係統(tǒng)電(diàn)泳(yǒng)體係(xì)中緩衝液 pH 值與凝(níng)膠中的(dí)相同(tóng)。帶(dài)電顆(kē)粒在電場作用下(xià)，主要靠電荷和分子篩(shāi)效(xiào)應。不(bù)連(lián)續(xù)係統(tǒng)中(zhōng)帶(dài)電顆(kē)粒在電場中(zhōng)泳動不僅有電(diàn)荷(hé)效應，分子篩效應，還(huán)具有濃縮(suō)效應，因(yīn)而其分(fēn)離條帶(dài)清(qīng)晰度(dù)及分辨率均(jūn)較(jiào)前者佳。

                                         

不連續係統(tǒng)的(dí)濃縮效應(yīng)：

凝(níng)膠(jiāo)層的(dí)不(bù)連續性：濃縮(suō)膠(jiāo)的孔徑大(dà)，分離(lí)膠的孔(kǒng)徑小。在(zài)電(diàn)場的(dí)作用下，蛋(dàn)白質顆(kē)粒在大孔膠(jiāo)中遇到的(dí)阻(zǔ)力小，移動快(kuài)。而(ér)在(zài)小(xiǎo)孔(kǒng)膠中遇(yù)到(dào)的(dí)阻(zǔ)力大，移(yí)動慢。因此(cǐ)，在兩層凝(níng)膠的(dí)交界處，由於凝膠孔徑的不(bù)連(lián)續性(xìng)使樣品遷移受阻(zǔ)而壓縮成(chéng)很窄的(dí)區帶。緩衝液離子成(chéng)分和pH的(dí)不(bù)連(lián)續性：HCl易解(jiě)離(lí)出(chū)Cl-，它在電場(cháng)中(zhōng)遷(qiān)移率(shuài)大，走在zui前(qián)麵(miàn)，故(gù)稱為(wéi)快離(lí)子(zǐ)或(huò)前(qián)導(dǎo)離(lí)子。電(diàn)極緩(huǎn)衝液(yè)中的(dí)甘(gān)氨酸在pH6.8 的緩衝液(yè)中(zhōng)解離度很(hěn)小，僅為(wéi) 0.1-1%，因(yīn)而(ér)在電(diàn)場中遷移率(shuài)很小，稱為(wéi)慢離子(zǐ)或尾隨離子。蛋(dàn)白質(zhì)均帶負電荷(hé)，在電場中均移向(xiàng)正極(jí)，其有效遷移(yí)率(shuài)介於(yú)快(kuài)慢(màn)離 子之(zhī)間(jiān)，於是(shì)蛋白質就在(zài)快(kuài)慢離子間形成的(dí)界(jiè)麵處，被濃縮成極窄的區(qū)帶。當(dāng)進入pH8.8的分(fēn)離(lí)膠時(shí)，甘(gān)氨酸解離度增加，其(qí)有效遷(qiān)移率(shuài)超過蛋白質，因此氯離(lí)子和(hé)甘(gān)氨(ān)酸離(lí)子沿(yán)著離子界(jiè)麵繼續前(qián)進(jìn)。蛋(dàn)白質分子(zǐ)由於分(fēn)子量(liáng)大(dà)，被留(liú)在(zài)後麵，然後(hòu)分離成(chéng)多個(gè)區(qū)帶。