第七章(zhāng) 封(fēng)閉（Blocking）

   第七章 封(fēng)閉(bì)（Blocking）

   雜交(jiāo)膜(mó)上(shàng)有(yǒu)很多(duō)非特(tè)異性(xìng)的(dí)蛋(dàn)白(bái)質結合位點，為(wéi)防止(zhǐ)這些位(wèi)點與(yǔ)抗體結合(hé)引起非(fēi)特異的(dí)染(rǎn)色(sè)和背景(jǐng)，一(yī)般用惰(duò)性蛋白質或非(fēi)離子去汙(wū)劑封閉(bì)膜上(shàng)的(dí)未(wèi)結(jié)合位(wèi)點來降低(dī)抗(kàng)體的非(fēi)特異性結合。封(fēng)閉劑應該封閉(bì)所有未結(jié)合(hé)位點而(ér)不(bù)替換膜上(shàng)的靶蛋(dàn)白，不結合(hé)靶蛋(dàn)白(bái)的表位(wèi)，也不(bù)與(yǔ)抗(kàng)體或檢測試劑有(yǒu)交叉反(fǎn)應(yīng)。zui常見(jiàn)的封閉劑(jì)是 BSA，脫(tuō)脂(zhī)奶粉(fěn)，酪蛋(dàn)白，明(míng)膠和 Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液 PBST 或(huò)者(zhě) TBST。

5%脫脂(zhī)奶粉或 BSA（室(shì)溫孵育(yù) 1 h）

Western Blot 膜(mó)封(fēng)閉(bì)液

Tween-20 的(dí)作用：Tween-20 是一種(zhǒng)非(fēi)離子(zǐ)型去汙劑，有(yǒu)復性抗原的(dí)作用(yòng)，可(kě)提高特異性的識別能(néng)力(lì)。在做 westen blot 時(shí)，用(yòng)惰性(xìng)蛋白(bái)質(zhì)或非(fēi)離(lí)子(zǐ)去汙(wū)劑(jì)封(fēng)閉(bì)膜(mó)上(shàng)的未結(jié)合位點(diǎn)可(kě)以(yǐ)降低抗體的(dí)非特異性結(jié)合(hé)。Tween 這種(zhǒng)非離子(zǐ)型去汙劑(jì)在(zài)乳化(huà)蛋(dàn)白(bái)時，不(bù)破(pò)壞(huài)蛋(dàn)白的結構，可(kě)減少對蛋(dàn)白(bái)質之(zhī)間(jiān)原有(yǒu)的相互(hù)作用的破(pò)壞(huài)。離(lí)子型去汙劑如 SDS 則破壞蛋(dàn)白(bái)的結構(gòu)。

封(fēng)閉劑選擇的(dí)特(tè)殊情況：

脫脂(zhī)奶粉不(bù)能與生(shēng)物素(sù)化(huà)或伴刀豆(dòu)蛋白標記的抗體(tǐ)一起使用(yòng)，因(yīn)為脫脂奶粉(fěn)含有(yǒu)糖蛋(dàn)白和生物(wù)素(sù)。如果封閉劑(jì)中(zhōng)含(hán)磷酸酶，用磷(lín)酸(suān)化特(tè)異性抗(kàng)體(tǐ)分析磷酸(suān)化蛋白受(shòu)到影響，因為磷酸(suān)酶(méi)與(yǔ)印記(jì)膜上(shàng)的磷酸(suān)化蛋(dàn)白接(jiē)觸(chù)可使之(zhī)去(qù)磷(lín)酸化。檢(jiǎn)測(cè)磷(lín)酸(suān)化抗體(tǐ)時(shí)，不(bù)能使(shǐ)用(yòng)酪(lào)蛋白/脫脂奶粉(fěn)作(zuò)為封(fēng)閉劑(jì)。

一(yī)般封(fēng)閉條件(jiàn)為：

    室溫或者 37℃緩(huǎn)慢搖蕩(dàng) 1～2 h，特殊情況(kuàng)也可(kě) 4℃封(fēng)閉(bì)一(yī)夜(yè)。根(gēn)據結果情況(kuàng)調(tiáo)整(zhěng)封閉試(shì)劑的(dí)濃度和類(lèi)型。比如(rú)有時 BSA 比(bǐ)脫(tuō)脂奶(nǎi)粉更(gēng)有利於(yú)降低(dī)非特(tè)異性背(bèi)景，而(ér)有(yǒu)些(xiē)抗體則(zé)在(zài)脫脂奶(nǎi)粉封閉的(dí)情況(kuàng)下才能得到清晰的(dí)背(bèi)景(jǐng)。