第(dì)八章(zhāng) 抗體孵育

                                   第八(bā)章(zhāng) 抗(kàng)體孵(fū)育(yù)




一(yī)抗孵育(Primary antibody incubation)

參考一(yī)抗的(dí)說明書(shū)，按(àn)照適(shì)當比(bǐ)例用(yòng)封(fēng)閉(bì)液稀釋(shì)一抗(kàng)。吸(xī)盡(jìn)封閉液後，立即加(jiā)入(rù)稀釋好(hǎo)的一抗，室溫或 4℃在搖(yáo)床上緩慢搖動孵育(yù) 1～2 小時。如果一抗孵育一小(xiǎo)時效果(guǒ)不佳，可(kě)以在 4℃緩(huǎn)慢(màn)搖動(dòng)孵育一夜(yè)。（注(zhù)意：抗(kàng)體濃度(dù)過(guò)高會導致背景較深，過低(dī)會(huì)導(dǎo)致(zhì)和(hé)抗原(yuán)結(jié)合(hé)不充(chōng)分，出現(xiàn)假陰性(xìng) ）。回(huí)收一抗(kàng)。然(rán)後(hòu)加(jiā)入(rù) Western 洗(xǐ)滌液，在搖床上(shàng)緩慢搖動(dòng)洗滌 5-10 分(fēn)鐘。吸盡(jìn)洗(xǐ)滌液後，再加入(rù)洗滌液，洗滌 5-10 分鐘。共(gòng)洗滌 3 次。如果(guǒ)結果(guǒ)背景(jǐng)較(jiào)高(gāo)可(kě)以適當延長洗(xǐ)滌(dí)時間(jiān)並增(zēng)加洗滌(dí)次數。

 二抗孵(fū)育(Secondary antibody inucubation)

參考二抗(kàng)的說明(míng)書，按照適當比例用封閉液(yè)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記(jì)的(dí)二抗。吸盡洗滌液後，立即加入稀(xī)釋好的(dí)二抗，室溫(wēn)或(huò) 4℃在搖床(chuáng)上緩(huǎn)慢(màn)搖(yáo)動孵(fū)育(yù) 1～2 小(xiǎo)時。回收(shōu)二抗(kàng)。然後加入 Western 洗滌液(yè)，在搖床上緩(huǎn)慢搖動洗(xǐ)滌(dí) 5-10 分鐘。吸盡(jìn)洗滌(dí)液(yè)後(hòu)，再加入洗(xǐ)滌(dí)液(yè)，洗(xǐ)滌 5-10 分鐘。共洗滌 3 次。如(rú)果(guǒ)結果(guǒ)背(bèi)景較高(gāo)可以(yǐ)適(shì)當(dāng)延長洗滌時間並(bìng)增加(jiā)洗(xǐ)滌(dí)次(cì)數。前 2 步(bù)洗滌是為了洗去(qù)一抗和(hé)二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的(dí)效(xiào)果(guǒ)直接影響結果背景的深(shēn)淺，所(suǒ)以(yǐ)洗滌(dí)一(yī)定要(yào)幹淨。洗滌(dí)液使(shǐ)用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助於(yú)去除(chú)非特異性(xìng)的結(jié)合，減少背景。同時(shí)短(duǎn)時(shí)間多(duō)次的洗(xǐ)膜（如 5-6 次，每(měi)次 3 分鐘）比長時間(jiān)少(shǎo)次(cì)數的洗(xǐ)膜(mó)更有效。第 3 步 TBS 洗滌是(shì)為了(liǎo)洗去膜(mó)上(shàng)的 Tween-20，因(yīn)為它可以(yǐ)阻礙底(dǐ)物(wù)的沉積(jī)。

  注意事(shì)項

1. 抗體保(bǎo)存注(zhù)意(yì)事(shì)項(xiàng)：

收到(dào)抗(kàng)體後按(àn)要求離心(xīn)後再打開管(guǎn)蓋進行分裝和(hé)保存！

對於(yú)大部(bù)分(fēn)抗體，比較合適的保(bǎo)存(cún)方(fāng)式(shì)是分裝後保存在-20℃ 。

分(fēn)裝的(dí)量(liáng)以一次實驗用完為好，zui少不(bù)能少於 10 ul 每份。因(yīn)為(wéi)分裝(zhuāng)體(tǐ)積越小，抗(kàng)體(tǐ)的濃度(dù)越(yuè)可(kě)能(néng)會受(shòu)到(dào)蒸發以及管壁吸(xī)附的(dí)影響(xiǎng)。復融後的分裝(zhuāng)抗體如(rú)果(guǒ)一次用不完，將(jiāng)剩(shèng)餘母液保(bǎo)存在(zài) 40℃，避免再凍(dòng)起(qǐ)來(lái)！

避(bì)免(miǎn)將抗體保(bǎo)存在自(zì)動除霜冰箱(xiāng)中。

大部分抗體(tǐ)收(shōu)到(dào)後(hòu) 40℃短(duǎn)暫保存 1-2 周對抗(kàng)體活性是沒(méi)有影響的(dí)。長期保(bǎo)存，加入(rù)疊(dié)氮納，防(fáng)止細(xì)菌汙染(rǎn)。

2. 一抗/二(èr)抗(kàng)使用(yòng)問(wèn)題(tí)：

   一(yī)抗，二抗(kàng)的濃度一般(bān)要參照(zhào)抗體(tǐ)說(shuō)明書選擇zui適當的(dí)比例，一抗(kàng)二抗的選(xuǎn)擇(zé)直接影(yǐng)響實驗(yàn)結(jié)果以及(jí)背景(jǐng)的(dí)深(shēn)淺。要嚴格保(bǎo)證反應時間，洗膜(mó)要注(zhù)意盡可(kě)能地將(jiāng)一抗(kàng)二(èr)抗洗淨(jìng)，有(yǒu)利(lì)於降(jiàng)低背景(jǐng)；還要(yào)注意一(yī)抗二抗的匹(pǐ)配。

3. 天(tiān)然和非還原樣品(pǐn)問(wèn)題：

   有些抗體(tǐ)隻(zhī)能(néng)識別的(dí)表位(wèi)是非連續(xù)氨(ān)基酸(suān)，這些氨(ān)基酸雖(suī)然在蛋白質(zhì)一(yī)級結構(gòu)中彼(bǐ)此不(bù)連續(xù)，但是在(zài)空(kōng)間(jiān)結(jié)構(gòu)中則是(shì)靠在(zài)一起(qǐ)的。這(zhè)些抗(kàng)體就隻能識(shí)別靶蛋(dàn)白(bái)的空間結(jié)構(gòu)狀(zhuàng)態（抗體說明書(shū)中會有(yǒu)特殊說明）。對(duì)於(yú)這些(xiē)樣品(pǐn)，緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)和(hé)凝膠(jiāo)中(zhōng)就不(bù)能(néng)含有(yǒu) SDS，並且不(bù)能夠(gòu)對(duì)蛋(dàn)白(bái)進行(háng)加(jiā)熱變(biàn)性。有些(xiē)抗(kàng)體隻能識別蛋白的(dí)非還原狀(zhuàng)態(tài)如氧(yǎng)化狀(zhuàng)態，對此類(lèi)樣品(pǐn)，就需要將(jiāng)緩(huǎn)衝液(yè)和(hé)凝膠中的(dí)還(huán)原劑 DTT和 beta-巰基(jī)乙醇(chún)去(qù)除。