第(dì)九(jiǔ)章 蛋白(bái)顯(xiǎn)色

                                                      第(dì)九(jiǔ)章 蛋白顯色




    酶促(cù)反應(yīng)比同(tóng)位(wèi)素安全(quán)且(qiě)快速(sù)，已(yǐ)經(jīng)成(chéng)為(wéi) Western Blot 的(dí)主流檢測(cè)方法(fǎ)。酶促(cù)反應可以(yǐ)搭配不同的(dí)底物從(cóng)而實現不(bù)同(tóng)的顯色方法(fǎ)：化學發光(guāng)和底物顯色(sè)，前者靈(líng)敏(mǐn)度很高(gāo)，已(yǐ)經(jīng)達到皮(pí)克(kè)級(jí)別，甚至(zhì)還(huán)有飛克級別(bié)的，靈(líng)敏(mǐn)度超(chāo)過(guò)了同位素；而後者由於(yú)直(zhí)接(jiē)顯(xiǎn)色(sè)而操(cāo)作簡便(biàn)且(qiě)成(chéng)本低。

    大家(jiā)zui為熟悉(xī)熟(shú)悉當(dāng)數辣根過氧化(huà)物(wù)酶 HRP（Horseradish Peroxidase）和(hé)鹼(jiǎn)性(xìng)磷(lín)酸(suān)酶 AP（AlkalinePhosphatase），此(cǐ)外(wài)還(huán)有比較(jiào)少(shǎo)見(jiàn)的葡萄(táo)糖氧化(huà)酶(méi)（Glucose Oxidase）和(hé) β 半(bàn)乳糖苷(gān)酶（β-Galactosidase）。在(zài)酶連(lián)抗體(tǐ)中(zhōng)使(shǐ)用的酶(méi)通常是鹼性磷(lín)酸酶(méi)或(huò)辣根(gēn)過(guò)氧(yǎng)化(huà)物酶。鹼(jiǎn)性磷酸(suān)酶可以將(jiāng)無(wú)色的底(dǐ)物 5-溴-4-氯吲哚磷(lín)酸鹽（BCIP）轉化(huà)為(wéi)藍色的產物；而辣(là)根(gēn)過氧化(huà)物酶(méi)可(kě)以(yǐ)以(yǐ)H2O2為底物，將 3-氨(ān)基-9-乙(yǐ)基(jī)咔(kǎ)唑氧化成褐(hè)色產物或(huò)將 4-氯萘(nài)酚(fēn)氧(yǎng)化成藍色產物。另一種檢(jiǎn)測辣(là)根過(guò)氧化物酶(méi)的(dí)方法是(shì)用增強(qiáng)化(huà)學發(fā)光法，辣根(gēn)過(guò)氧化(huà)物(wù)酶在H2O2存(cún)在下，氧化(huà)化學(xué)發(fā)光(guāng)物質魯(lǔ)米諾(nuò)（luminol，氨(ān)基苯二酰(xiān)一肼）並發光，在化(huà)學增強劑存(cún)在下光強度可(kě)以(yǐ)增大 1000 倍，通(tōng)過將印跡放(fàng)在照相底(dǐ)片上感(gǎn)光就(jiù)可(kě)以檢測(cè)辣(là)根過(guò)氧(yǎng)化(huà)物酶的存在。

① HRP 標記(jì)二(èr)抗用 DAB 顯色，按順序依(yī)次將 DAB 三種劑各取(qǔ) 3 滴於 5 ml 蒸(zhēng)餾水中，避(bì)光混匀(yún)，將(jiāng)膜加(jiā)入(rù)顯色(sè)液中避光顯(xiǎn)色 5-15min 終(zhōng)止(zhǐ)反應(yīng)，對照(zhào) Marker 記(jì)錄(lù)實驗結(jié)果，將(jiāng) NC 膜(mó)晾(liàng)幹掃描保(bǎo)存。HRP的生色底(dǐ)物顯(xiǎn)色有(yǒu) DAB，4-CN，CN/DAB，AEC 和 TMB 等。

               

     HRP 化學發光(guāng)反(fǎn)應底物主要有 Luminol，ECL 和 SuperSignal 係列(liè)。可直接(jiē)從公司(sī)購(gòu)買試(shì)劑盒(hé)，操作(zuò)比較簡單，原理(lǐ)如(rú)下（二抗用 HRP 標記）：反應底(dǐ)物(wù)為過(guò)氧(yǎng)化物(wù)+魯米諾，如(rú)遇到(dào) HRP，即發光，可使(shǐ)膠片曝(pù)光，就可(kě)洗出(chū)條帶(dài)。

                           

② AP顯色底物生成(chéng)的產物主(zhǔ)要是藍紫色(sè)，成像性(xìng)好(hǎo)容易拍(pāi)照(zhào)。 AP的底(dǐ)物(wù)顯然(rán)更穩定，不像HRP那(nà)樣需要新(xīn)鮮 配製(zhì) 的 H2O2一 類 的不穩(wěn) 定成(chéng) 分(fēn)，作 為試 劑(jì)盒可 以保 存(cún)時間 更(gēng)長 。常用顯 色(sè)底(dǐ)物 的(dí)是(shì)BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3 ’ -Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ， NBT (Nitro-Blue TetrazoliumChloride)和INT。

③ 底(dǐ)物發光法：將兩種(zhǒng)顯(xiǎn)色(sè)底物(wù) 1:1 等體積混合後將(jiāng)其覆(fù)蓋在膜表麵使其(qí)均匀(yún)，用(yòng)玻璃(lí)膠(jiāo)片把(bǎ)膜(mó)包(bāo)起來，馬上(shàng)在(zài)暗室中將 X 光(guāng)片覆蓋(gài)在(zài)膜的上麵(miàn)（時間(jiān)根據光(guāng)的亮(liàng)度來(lái)衡量），顯影(yǐng)，定影。（注(zhù)意：發光(guāng)法檢(jiǎn)測的(dí)時候曝光時(shí)間要(yào)恰(qià)到好處(chǔ)，過短(duǎn)會導致曝光(guāng)不(bù)*，影(yǐng)響條(tiáo)帶亮度，過(guò)長(cháng)會導致(zhì)熒(yíng)光信號衰弱，也會(huì)使背景(jǐng)顏色加深）除了(liǎo)酶連(lián)二抗作為指(zhǐ)示(shì)劑，也可(kě)以(yǐ)使用其(qí)它(tā)指示(shì)劑，比如(rú)：熒光(guāng)素(sù)異硫氰(qíng)酸(suān)鹽(yán)標記的二抗（可通(tōng)過紫外(wài)燈產(chǎn)生熒光(guāng)）；生物素結(jié)合的二(èr)抗(kàng)等等。

關於(yú)磷酸(suān)化(huà)蛋白(bái)檢測的注意(yì)事(shì)項：

① 保持待(dài)測蛋(dàn)白處於磷酸化狀(zhuàng)態(tài)，在(zài)標本(běn)提取液(yè)中加(jiā)入足夠(gòu)的磷(lín)酸(suān)酶抑(yì)製(zhì)劑(jì)（NaF，可以(yǐ)防(fáng)止去(qù)磷酸化(huà)），並將標本時(shí)刻(kè)保(bǎo)持(chí)在冰浴(yù)中(zhōng)。

② 使(shǐ)用(yòng) 5%的(dí) BSA 作為(wéi)封(fēng)閉試(shì)劑(jì)，不(bù)能使用(yòng)脫脂奶粉（因為脫脂奶(nǎi)粉中(zhōng)含有酪(lào)蛋(dàn)白(bái)，會(huì)出(chū)現很(hěn)高的背景）。

③ 請(qǐng)謹記(jì)蛋白的磷酸(suān)化是需要誘導(dǎo)的，當信號低或(huò)者無信號(hào)時有(yǒu)可能是(shì)磷酸化誘導不充(chōng)分(fēn)！確(què)保使用陽(yáng)性(xìng)對照(zhào)。