TA克(kè)隆廠家實驗原(yuán)理　

  TA克(kè)隆(lóng)是利(lì)用耐(nài)熱聚合酶，如Taq聚(jù)合酶，Tfl，Tth等(děng)具(jù)有末(mò)端轉移酶活(huó)性，而(ér)不具(jù)有(yǒu)3 一(yī)5外切(qiē)酶(méi)的(dí)校(xiào)準活性(xìng)，即(jí)在(zài)PCR產(chǎn)物(wù)的(dí)兩個3 末端(duān)加(jiā)上(shàng)未配對(duì)的單(dān)一A凸出尾 ，質(zhì)粒(lì)載(zǎi)體(tǐ)提(tí)供(gōng)綫性3末(mò)端單(dān)一(yī)的T凸出(chū)尾，使該載體(tǐ)能(néng)夠直接(jiē)與PCR產物(wù)高(gāo)效(xiào)連接(jiē)
。TA克(kè)隆技術比其它(tā)PCR克隆方法有(yǒu)更(gēng)高的重組效率
。

TA克(kè)隆隻需(xū)4個(gè)步(bù)驟：①擴增(zēng)目(mù)的PCR產物(wù)；②製備(bèi)T克隆載體；③PCR產物(wù)直接克(kè)隆至T載體上(shàng)④轉化並(bìng)篩選重組(zǔ)子(zǐ)
。

TA克隆廠家（clone）：無性繁(fán)殖——應用酶(méi)學的方法，在體(tǐ)外將(jiāng)目(mù)的(dí)基(jī)因與(yǔ)載體DNA結(jié)合(hé)成具(jù)有自我復製能(néng)力的(dí)DNA分子（重組(zǔ)子(zǐ)），再通過轉化或(huò)轉染宿主細胞，篩選(xuǎn)出含有(yǒu)目(mù)的基因轉化子，進(jìn)行擴增(zēng)，提取(qǔ)獲得(dé)大量(liáng)同(tóng)一DNA

實(shí)驗(yàn)步驟

（1）擴(kuò)增(zēng)後(hòu)的(dí)PCR產(chǎn)物與(yǔ)T載(zǎi)體(tǐ)的(dí)連接(jiē)

取(qǔ)1隻(zhī)無菌Ep管(guǎn)，用(yòng)微量進樣(yàng)器按(àn)下(xià)列(liè)順序加(jiā)入(rù)各成分(fēn)
。

10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

PCR產(chǎn)物約(yuē)0.3 pmol

T載體約0.03pmol

T4 DNA Ligase 1ul

ddH2O 加至 25ul

*1 DNA的摩(mó)爾數應控製在載體(tǐ)DNA摩爾數的3－10倍
。

*2 相同末(mò)端的(dí)載(zǎi)體與DNA進(jìn)行(háng)連接時，應首先將(jiāng)載體進(jìn)行去(qù)磷(lín)酸化(huà)處(chǔ)理(lǐ)，以防(fáng)止其自身環化
。

（2）蓋(gài)好(hǎo)蓋子，用手指輕彈(dàn)Ep管數(shù)次，並於(yú)台(tái)式離心機離心(xīn)2s 以集中(zhōng)溶(róng)液
。

（3）將反(fǎn)應(yīng)管放(fàng)入4℃金屬(shǔ)浴中反應(yīng)20h
。

（4）取(qǔ)出約2ul的(dí)DNA連接液進(jìn)行瓊(qióng)脂糖(táng)凝膠(jiāo)電(diàn)泳(yǒng)，鑒定(dìng)連接結果，與(yǔ)未(wèi)經(jīng)連接(jiē)的質粒DNA和酶切DNA一(yī)同作(zuò)電泳(yǒng)
。

（5）用0.1×TE將連(lián)接(jiē)混合(hé)物稀釋(shì)至(zhì)50ul，使(shǐ)用(yòng)10ul轉化(huà)大腸杆菌感受態細(xì)胞(bāo)
。

（6）通過(guò)Amp抗(kàng)性(xìng)來篩(shāi)選(xuǎn)轉化子，轉(zhuǎn)化(huà)子擴增後，可(kě)將轉化的質粒提取出，進(jìn)行電泳，酶(méi)切等進一步(bù)鑒定
。