TA克(kè)隆（TA-cloning）

    （TA-cloning）是利(lì)用(yòng)Taq聚合(hé)酶(méi)的特(tè)性將PCR產物(wù)克隆的方法，又稱(chēng)為T-載(zǎi)體克隆(lóng)。

     在四(sì)種(zhǒng)dNTP存(cún)在(zài)下可以向非特性(xìng)的(dí)PCR產物(wù)的3’末端(duān)特異性(xìng)的添(tiān)加(jiā)一(yī)個(gè)A。這也成為(wéi)Taq酶(méi)催(cuī)化的(dí)PCR產(chǎn)物不(bù)能(néng)的(dí)連接至(zhì)平(píng)末端(duān)載體(tǐ)的(dí)主(zhǔ)要原(yuán)因。相反(fǎn)地(dì)，如果此時(shí)有(yǒu)一個綫(xiàn)性的帶有(yǒu)粘性(xìng)T末(mò)端的(dí)載(zǎi)體(tǐ)DNA（T載體），那(nà)麼帶有(yǒu)A粘(nián)性末(mò)端的(dí)PCR產物就(jiù)可以的插入載體DNA中(zhōng)。這(zhè)種(zhǒng)方法被稱為(wéi)TA克隆(lóng)。

 

實(shí)驗(yàn)材料
：

Invitrogen公(gōng)司提(tí)供的TOPO 快(kuài)速(sù)TA 克隆(lóng)試劑盒。我們(mén)采用(yòng)pCR®II-TOPO®體係。

內(nèi)含TOPO TACloning® reagents （Box 1） 和 One Shot® Chemically Competent cells （Box 2）.

TOPO 反(fǎn)應(yīng)鹽溶液(yè)
：200 mM NaCl,10 mM MgCl2。

 

實(shí)驗步驟(zhòu)
：

 

總體步(bù)驟
：

PCR 反應

進(jìn)行TOPO反(fǎn)應(yīng)，連接(jiē)PCR產(chǎn)物與TOPO載(zǎi)體(tǐ)

用(yòng)連接(jiē)好的(dí)TOPO克(kè)隆(lóng)轉(zhuǎn)化(huà)TOPO感(gǎn)受(shòu)態(tài)細胞(bāo)

藍白(bái)斑篩(shāi)選(xuǎn)

 

細節
：

1，PCR 反(fǎn)應(yīng)

按正(zhèng)常步驟(zhòu)用Taq聚(jù)合酶(méi)進(jìn)行(háng)PCR反(fǎn)應循環。

 

2，進(jìn)行(háng)TOPO反(fǎn)應，連接(jiē)PCR產物與TOPO載(zǎi)體(tǐ)

在反(fǎn)應體係中加入(rù)如下反(fǎn)應(yīng)物
：

新鮮(xiān)的(dí)PCR產物1ul

TOPO反(fǎn)應(yīng)鹽(yán)溶(róng)液 1ul

無(wú)菌(jūn)水 4ul

TOPO® vector 1ul

共 6ul

輕輕混合以上反應(yīng)物，在室(shì)溫(wēn)（22oC-23oC）溫育(yù)5分(fēn)鐘(zhōng)。

將以上反應物置(zhì)於(yú)冰(bīng)上，進行(háng)轉(zhuǎn)化(huà)

 

3，用(yòng)連接(jiē)好的TOPO克隆轉化(huà)TOPO感(gǎn)受態(tài)細(xì)胞(bāo)

向試劑盒提供的 One Shot® Chemically Competent E. coli中加入(rù)2ul以上反應(yīng)液，輕輕混匀(yún)。在(zài)冰(bīng)上(shàng)進行轉染(rǎn)10分鐘。

在42oC下熱刺激(jī)細胞(bāo)30秒(miǎo)，然後馬(mǎ)上轉(zhuǎn)移至冰(bīng)上(shàng)。

向體(tǐ)係(xì)中加(jiā)入250ul 室溫(wēn)下的(dí)SOC 培養液(yè)。

水平離心(xīn)轉化管(guǎn)（200rpm, 37oC）1小(xiǎo)時。

用10~50ul 轉(zhuǎn)化液(yè)向(xiàng)預熱(rè)的培(péi)養基鋪(pū)板。

 

4，藍白斑篩選(xuǎn)

取出10個白色(sè)或(huò)淺藍色(sè)的菌落在含(hán)有50ug/ml卡(qiǎ)那黴素或(huò)氨苄青(qīng)黴素(sù)LB培(péi)養基中培養(yǎng)。

提(tí)純質(zhì)粒(lì)，進(jìn)行鑒定。

 

 

其(qí)中的T載體可以(yǐ)用以下
：

Ø 一種載體(tǐ)可以用限製性內切酶如XcmI, HphI, 與MobII 酶切(qiē)消解產生，3‘末端未(wèi)配對的T。

Ø 應(yīng)用末端(duān)轉移酶與雙脫氧TTP加入(rù)一個突出(chū)的(dí)T殘(cán)基到(dào)綫(xiàn)形化載體(tǐ)的3’末(mò)端(duān)。

Ø 應(yīng)用(yòng)不依賴(lài)末端的(dí)Taq DNA聚合(hé)酶(méi)的末(mò)端轉移酶活(huó)性在(zài)綫形化載體(tǐ)的3‘末端出(chū)的(dí)羥(qiǎng)基基團上催(cuī)化連接上(shàng)一個(gè)T鹼(jiǎn)基(jī)。

 

    但是並非(fēi)所有(yǒu)可用(yòng)於(yú)PCR的耐(nài)熱(rè)DNA聚(jù)合(hé)酶都具(jù)有(yǒu)非(fēi)模版依賴的A添加(jiā)能力(lì)。例如常用於高(gāo)精(jīng)度(dù)PCR反(fǎn)應的Pfu 聚合酶(méi)隻能(néng)產(chǎn)生平末端，因(yīn)而(ér)不(bù)能(néng)夠(gòu)用(yòng)於TA克(kè)隆(lóng)。

 

     目(mù)前(qián)，T載體可以從許多(duō)供應(yīng)商(shāng)那(nà)裏購買得(dé)到(dào)克隆化的試劑盒(hé)，如pCR-Script[SK+]（from Statagene 公(gōng)司），PCRII的TA克隆試(shì)劑盒（from Invitrogen 公司(sī)），PGEM-T （from Promega 公(gōng)司(sī)）等(děng)等(děng)。

 

    以下以PCRII的TA克隆(lóng)試(shì)劑(jì)盒（from Invitrogen 公司(sī)）為(wéi)例講述(shù) 的(dí)過程
：

    從牛痘(dòu)病毒（Vaccinia）中(zhōng)提取(qǔ)的DNA拓(tuò)撲異(yì)構酶(méi)1可以識(shí)別(bié)5’-CCCTT序列，並(bìng)連接5’-CCCTT和外源DNA（Shuman, 1991，1994），因而可用於(yú)TA cloning。

 

參考(kǎo)文(wén)獻(xiàn)
：

1. Joseph Sambrook，David W Russell. Molecular cloning（3rd edition）

2. Shuman, S. （1991）.  Recombination Mediated by Vaccinia Virus DNA Topoisomerase I in Escherichia coli is Sequence Specific. Proc. Natl. Acad. Sci. 

3. Holton TA, Graham MW.  A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.  Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19（5）:1156

4. Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS.  Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19（5）:1154.

5. Borovkov AY, Rivkin MI.  XcmI-containing vector for direct cloning of PCR products. Biotechniques. 1997 May;22（5）:812-4. 

6. Kovalic D, Kwak JH, Weisblum B.  General method for direct cloning of DNA fragments generated by the polymerase chain reaction.  Nucleic Acids Res. 1991 Aug 25;19（16）:4560. 

7. Hengen PN.  Fidelity of DNA polymerases for PCR. Trends Biochem Sci. 1995 Aug;20（8）:324-5. 

8. Leal, J.F.M.; López-Barea, J.; Dorado, G.  T-vector cloning and high performance PCR with SuperTth from Thermus thermophilus  Genetic Analysis: Biomolecular Engineering Volume: 12, Issue: 2, October, 1995, pp. 119-121  

9. Hoover C, 1998 July 8. Invitrogen web catalog.  Accessed 1999 Feb 14.