淺談質粒載體的構建(jiàn)及類型

一，必須(xū)具備(bèi)的(dí)基(jī)本條件

   現行(háng)通用(yòng)的基因(yīn)克隆(lóng)載體(tǐ)，絕(jué)大多數就(jiù)是(shì)以質(zhì)粒為基(jī)礎改(gǎi)建而成的(dí)。一(yī)般(bān)說來，一(yī)種理想的用作克(kè)隆(lóng)載(zǎi)體的(dí)質(zhì)粒(lì)必(bì)須(xū)滿足如(rú)下幾(jī)個(gè)方麵的條(tiáo)件：
（1）具有復(fù)製起點

（2）具有(yǒu)抗菌素抗生基(jī)因(yīn)

（3）具若幹限製(zhì)酶(méi)單(dān)一(yī)識別位點

（4）具(jù)有較小的分(fēn)子(zǐ)量(liáng)和(hé)較(jiào)高的拷貝(bèi)數 

二，的(dí)選(xuǎn)擇記號(hào)

　　在基因克隆(lóng)中采(cǎi)用的質粒載(zǎi)體的選擇(zé)記(jì)號(hào)，包(bāo)括有新陳代謝特(tè)性，對大(dà)腸(cháng)杆菌素E1的(dí)免(miǎn)疫性(xìng)，以(yǐ)及抗菌(jūn)素(sù)抗性(xìng)等(děng)多種。但絕(jué)大多靈敏的質粒(lì)載體(tǐ)都是(shì)使(shǐ)用(yòng)抗菌(jūn)素抗性記號(hào)。基因克隆實(shí)驗中(zhōng)常用(yòng)的(dí)幾種(zhǒng)抗菌(jūn)素(sù)的作(zuò)用(yòng)方式及其抗性(xìng)機理列(liè)於。

三，不同(tóng)類型的

　（1）高(gāo)拷貝數的(dí)質(zhì)粒載(zǎi)體(tǐ)
　　適(shì)於(yú)分(fēn)離(lí)大量的高純度(dù)的克(kè)隆(lóng)基(jī)因的(dí)DNA段。如(rú)ColE1，pMB1或(huò)它們的(dí)派(pài)生質粒(lì)。它們不僅(jǐn)具(jù)有(yǒu)低分(fēn)子(zǐ)量(liáng)，高拷(kǎo)貝(bèi)數的優點，而且(qiě)在(zài)沒有(yǒu)蛋白(bái)質合(hé)成的條件(jiàn)下(xià)仍(réng)能繼(jì)續(xù)復製。因(yīn)此，若(ruò)在處於對(duì)數生長(cháng)晚期的含(hán)有ColE1一類(lèi)質粒的大腸杆(gān)菌培養物中(zhōng)，加入(rù)適(shì)量的蛋白質(zhì)合成抑製劑講如氯黴素或(huò)壯觀黴素處(chǔ)理(lǐ)之(zhī)後，每(měi)個(gè)細胞中(zhōng)的質(zhì)粒拷貝數(shù)則(zé)可擴增到1000～3000個之多。如果加入高(gāo)濃度(dù)的尿(niào)核(hé)苷，質粒(lì)DNA又可(kě)進(jìn)一步擴增(zēng)2～3倍(bèi)。


　（2）低拷貝數(shù)的質粒(lì)載(zǎi)體
　　適合於克隆含量過高(gāo)對(duì)寄主代謝有害的DNA。例(lì)如(rú)，pLG338，pLG339及pHSG415。這類質粒載體的(dí)一個(gè)普(pǔ)遍性(xìng)問題是，由(yóu)於它們(mén)體積小(xiǎo)，拷貝數低，與此相應的基因劑(jì)量也就較少，因此要製備(bèi)大(dà)量(liáng)的克隆DNA就(jiù)很(hěn)困難。


　（3）失(shī)控的(dí)質粒載(zǎi)體(tǐ)
　　失控(kòng)的(dí)質(zhì)粒載(zǎi)體（runaway plasmid vectors）：是一些低(dī)拷貝的(dí)質粒，其復(fù)製控(kòng)製是溫(wēn)度(dù)敏(mǐn)感(gǎn)型(xíng)的，也(yě)就是說在不同(tóng)的溫(wēn)度(dù)下(xià)，拷貝數(shù)會(huì)有(yǒu)顯(xiǎn)著的(dí)變化(huà)。
　　B.E.Uhlin等人(rén)（1979）首先發(fā)展(zhǎn)了(liǎo)失控(kòng)的質粒(lì)載(zǎi)體(tǐ)pBEU1和Pbeu2。這(zhè)種質粒載體在30℃下(xià)，每(měi)個寄(jì)主(zhǔ)細胞(bāo)中隻(zhī)含(hán)有(yǒu)適量的(dí)拷貝(bèi)數，而當(dāng)培養(yǎng)溫度超過(guò)35℃時，質(zhì)粒(lì)的(dí)復(fù)製便(biàn)失(shī)去了(liǎo)控製，每(měi)個(gè)細(xì)胞(bāo)中的拷(kǎo)貝數(shù)便持(chí)續上(shàng)升。在這種高溫環境(jìng)下，細(xì)胞的生長(cháng)蛋(dàn)白(bái)質的(dí)合(hé)成可(kě)按正(zhèng)常的(dí)速率(shuài)持續2～3小時(shí)。這(zhè)期間(jiān)編碼在(zài)質(zhì)粒載體(tǐ)上的基(jī)因產物(wù)便超(chāo)過了常(cháng)量。zui後，細胞(bāo)生(shēng)長(cháng)受到了(liǎo)抑(yì)製，並(bìng)失(shī)去(qù)了(liǎo)存活的(dí)能(néng)力(lì)，但(dàn)在這個階(jiē)段(duàn)質(zhì)粒DNA可累積到占細(xì)胞(bāo)總DNA的50%。


　（4）插(chā)入失活型的(dí)質(zhì)粒載(zǎi)體
　　選(xuǎn)用插(chā)入失活(huó)型(xíng)質粒，將外源DNA段(duàn)插入在會(huì)導致選擇記號(hào)基因（如(rú)tetr，ampr，cmlr等(děng)）失活的(dí)位點(diǎn)，就有可能(néng)通過抗(kàng)菌(jūn)素(sù)抗性的(dí)篩選，大幅(fú)度(dù)地提高(gāo)獲得陽性克(kè)隆的(dí)幾率。除了pDF471和(hé)Pdf42之外，都具(jù)有基(jī)因插入失活的(dí)克隆(lóng)位(wèi)點(diǎn)，因此都屬於插入失(shī)活(huó)型的(dí)質粒(lì)載(zǎi)體(tǐ)。


　（5）正(zhèng)選擇(zé)的(dí)質粒(lì)載(zǎi)體
　　正選(xuǎn)擇(zé)質(zhì)粒(lì)載體（direct selection vectors）：這(zhè)種(zhǒng)質(zhì)粒載(zǎi)體具(jù)有具有(yǒu)直接選擇記(jì)號並賦(fù)予寄主細胞(bāo)相應的(dí)表(biǎo)型。通(tōng)過選擇具這(zhè)種表(biǎo)型特(tè)征(zhēng)的(dí)轉(zhuǎn)化子(zǐ)，便可大(dà)大(dà)降(jiàng)低需要篩選的轉化子的(dí)數量，從而(ér)減輕了實(shí)驗的(dí)工作量(liáng)，提高了選(xuǎn)擇(zé)的敏(mǐn)感性。


　（6）表達(dá)型(xíng)的(dí)質(zhì)粒載體(tǐ)
　　使克隆在大腸杆(gān)菌(jūn)中特定(dìng)位點的(dí)外源(yuán)真核(hé)基因(yīn)的編碼(mǎ)序(xù)列(liè)置於大腸(cháng)杆(gān)菌的轉錄-轉譯(yì)信(xìn)號(hào)控製(zhì)之(zhī)下，並(bìng)能在(zài)大(dà)腸(cháng)杆(gān)菌(jūn)細胞(bāo)中正(zhèng)常(cháng)轉錄並(bìng)轉(zhuǎn)譯(yì)成相應(yīng)蛋白質(zhì)的(dí)克隆(lóng)載體(tǐ)特稱(chēng)為表(biǎo)達載體（expression vectors）。它分為(wéi)表(biǎo)達型質(zhì)粒載(zǎi)體(tǐ)和表達型噬菌體載(zǎi)體兩種不同(tóng)的類(lèi)型。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　      一(yī)種(zhǒng)典型的大(dà)腸杆菌(jūn)表(biǎo)達型質粒載體的主要組成部分(fēn)，包(bāo)括大(dà)腸(cháng)杆(gān)菌(jūn)的啟動子及(jí)操縱全(quán)點序(xù)列，多克隆位(wèi)點，轉錄(lù)及轉譯信(xìn)號，質粒載(zǎi)體的復(fù)製起(qǐ)點(diǎn)及(jí)抗菌(jūn)素(sù)抗性(xìng)基因(yīn)

     那(nà)些沒有經(jīng)過(guò)以(yǐ)基因克隆為目標的體外修(xiū)飾(shì)改造(zào)的(dí)質(zhì)粒被(bèi)成為天然質(zhì)粒。在(zài)大(dà)腸(cháng)杆(gān)菌中，常見(jiàn)的(dí)要用於(yú)基(jī)因(yīn)克(kè)隆(lóng)的天(tiān)然(rán)質粒(lì)有(yǒu)ColE1RSF2124和pSC101等(děng)。
　　鑒於天然(rán)質粒(lì)用(yòng)作(zuò)基因克隆載體(tǐ)存(cún)在(zài)著不同程(chéng)度(dù)的(dí)局限(xiàn)性(xìng)，所以科學工(gōng)作者(zhě)便在(zài)其(qí)基(jī)礎上進行了修(xiū)飾改造(zào)，首(shǒu)先發(fā)展(zhǎn)出了(liǎo)一批低(dī)分子(zǐ)量，高拷貝，多選擇(zé)記(jì)號的(dí)。