淺(qiǎn)析質(zhì)粒與載體

 

一，


a復(fù)製(zhì)起(qǐ)始(shǐ)位點Ori 即(jí)控製(zhì)復製(zhì)起始(shǐ)的位點。原核(hé)生物DNA分子(zǐ)中(zhōng)隻有一個(gè)復製起始點(diǎn)。而真核(hé)生(shēng)物DNA分子有(yǒu)多個復(fù)製(zhì)起始(shǐ)位點(diǎn)。
b 抗生素抗性基因 可(kě)以便(biàn)於加(jiā)以(yǐ)檢(jiǎn)測，如Amp+ ,Kan+
c 多克隆(lóng)位(wèi)點MCS 克(kè)隆攜帶(dài)外源(yuán)基因段(duàn)
d P/E 啟動(dòng)子/增強子(zǐ)
e Terms 終止信號
f 加(jiā)poly（A）信號 可以起到(dào)穩(wěn)定(dìng)mRNA作用


二(èr)，


*步(bù)：首(shǒu)先(xiān)看(kàn)Ori的位置，了(liǎo)解(jiě)質粒的類型(xíng)（原核/真核/穿梭質粒）
第二步：再(zài)看篩(shāi)選標記，如抗(kàng)性，決(jué)定(dìng)使(shǐ)用(yòng)什麼(mó)篩選(xuǎn)標記。
（1）Ampr 水解(jiě)β－內酰胺環(huán)，解(jiě)除(chú)氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止(zhǐ)四環(huán)素(sù)進(jìn)入(rù)細胞。
（3）camr 生成氯黴(méi)素羥(qiǎng)乙酰基衍(yǎn)生物(wù)，使(shǐ)之失(shī)去(qù)毒性(xìng)。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸(suān)轉移酶(méi) 使(shǐ)G418（長那(nà)黴素衍(yǎn)生(shēng)物）失活(huó)
（5）hygr 使潮(cháo)黴素β失(shī)活。
第(dì)三步(bù)：看多克隆位點（MCS）。它(tā)具(jù)有多(duō)個(gè)限製酶的單(dān)一切點。便(biàn)於(yú)外(wài)源(yuán)基(jī)因(yīn)的插入。如果(guǒ)在這(zhè)些位點外有外(wài)源(yuán)基因的(dí)插(chā)入(rù)，會導致某種標(biāo)誌(zhì)基(jī)因的(dí)失活(huó)，而便(biàn)於(yú)篩選(xuǎn)。決定能不能(néng)放目(mù)的基(jī)因(yīn)以(yǐ)及如(rú)何(hé)放置目的(dí)基因(yīn)。
第(dì)四(sì)步：再(zài)看(kàn)外源(yuán)DNA插入段(duàn)大小(xiǎo)。質(zhì)粒(lì)一(yī)般隻能(néng)容納(nà)小(xiǎo)於10Kb的外源DNA段。一般(bān)來說(shuō)，外源DNA段越長，越(yuè)難(nán)插入(rù)，越不穩定，轉化效(xiào)率(shuài)越(yuè)低(dī)。
第五步：是(shì)否含有(yǒu)表(biǎo)達係統元(yuán)件(jiàn)，即(jí)啟動子(zǐ)－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄(lù)終(zhōng)止信號。這是(shì)用來區別克(kè)隆載(zǎi)體與(yǔ)表達(dá)載體。克(kè)隆載體(tǐ)中加入(rù)一些(xiē)與表(biǎo)達調控(kòng)有關的元件即成為(wéi)表達(dá)載(zǎi)體(tǐ)。選(xuǎn)用那(nà)種載體(tǐ)，還是要(yào)以實驗目的(dí)為準(zhǔn)繩。
啟(qǐ)動(dòng)子(zǐ)－核糖(táng)體結合位點－克(kè)隆(lóng)位(wèi)點－轉錄終止信號
a 啟(qǐ)動(dòng)子(zǐ)－促進DNA轉錄的(dí)DNA順序，這個(gè)DNA區(qū)域常(cháng)在基因(yīn)或操(cāo)縱(zòng)子(zǐ)編碼順序的上(shàng)遊(yóu)，是DNA分(fēn)子上可(kě)以(yǐ)與RNApol特(tè)異性(xìng)結合並使之開始轉錄(lù)的部(bù)位(wèi)，但啟動(dòng)子本身(shēn)不被轉錄(lù)。
b增(zēng)強子/沉默子－為(wéi)真核(hé)基因(yīn)組(zǔ)（包(bāo)括真核(hé)病毒基(jī)因組(zǔ)）中的一(yī)種(zhǒng)具有增強(qiáng)鄰(lín)近基因(yīn)轉錄過程的調控順(shùn)序。其作用與增(zēng)強子(zǐ)所在的位置或(huò)方向無關。即在所(suǒ)調(tiáo)控基(jī)因(yīn)上遊或(huò)下(xià)遊(yóu)均可發揮作用。/沉默(mò)子－負增(zēng)強子，負調控(kòng)序(xù)列。
c核糖體結合(hé)位點(diǎn)/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖(táng)體
d 轉(zhuǎn)錄終(zhōng)止順(shùn)序（終止子）/翻譯終(zhōng)止密(mì)碼(mǎ)子：結(jié)構基(jī)因的zui後(hòu)一(yī)個外(wài)顯(xiǎn)子(zǐ)中有一個AATAAA的保(bǎo)守(shǒu)序(xù)列，此(cǐ)位點(diǎn)down－stream有一段GT或T富豐區，這2部分(fēn)共同(tóng)構成poly（A）加尾(wěi)信號(hào)。結構基因的(dí)zui後(hòu)一個外顯(xiǎn)子中有(yǒu)一個AATAAA的保守序列(liè)，此位點down－stream有(yǒu)一段GT或T富豐(fēng)區(qū)，這2部(bù)分共同構成(chéng)poly（A）加(jiā)尾信號(hào)。
 


三(sān)，


1. 載體的(dí)概念(niàn)
    載體主(zhǔ)要(yào)有病(bìng)毒和(hé)非病(bìng)毒(dú)兩(liǎng)大類(lèi),即要(yào)把(bǎ)一個(gè)有用的基(jī)因（目的基因——研(yán)究或(huò)應用基因）通過(guò)基因工程手段(duàn)送到(dào)生物細胞（受(shòu)體細(xì)胞(bāo)），需要運載工(gōng)具（交通(tōng)工(gōng)具）攜(xié)帶(dài)外(wài)源(yuán)基(jī)因進入受體細(xì)胞(bāo)，這種(zhǒng)運(yùn)載工(gōng)具(jù)就叫做載體(tǐ)（vector）。
P.S.基(jī)因(yīn)工(gōng)程所用的vector實際上(shàng)是DNA分子(zǐ)，是(shì)用來(lái)攜(xié)帶(dài)目的基因段進(jìn)入(rù)受體(tǐ)細胞(bāo)的DNA


2. 載體的分類
按功能(néng)分(fēn)成：

（1）克(kè)隆載體(tǐ)都(dū)有一個(gè)鬆弛的復製子(zǐ)，能(néng)帶動(dòng)外源(yuán)基因(yīn)，在(zài)宿主細(xì)胞(bāo)中(zhōng)復(fù)製(zhì)擴增。它是用(yòng)來克隆(lóng)和(hé)擴增DNA段（基(jī)因(yīn)）的載(zǎi)體。（所以有(yǒu)時(shí)實驗(yàn)時擴(kuò)增效(xiào)率低(dī)下(xià)，要注意是不(bù)是使(shǐ)用的嚴謹(jǐn)行載(zǎi)體(tǐ)）
（2）表(biǎo)達載體 具(jù)有克隆載體(tǐ)的基(jī)本元件(jiàn)（ori,Ampr,Mcs等）還具有(yǒu)轉(zhuǎn)錄(lù)/翻譯所必(bì)需的DNA順序的載(zǎi)體(tǐ)。


按(àn)進入受體(tǐ)細(xì)胞類型分(fēn)：

（1）原核載體 

（2）真核(hé)載(zǎi)體 

（3）穿梭載(zǎi)體（sbuttle vector）指(zhǐ)在(zài)兩種宿(sù)主生(shēng)物(wù)體內復製(zhì)的載(zǎi)體分子，因而可(kě)以運載(zǎi)目的(dí)基因（穿梭往(wǎng)返(fǎn)兩種生(shēng)物之(zhī)間(jiān)）.

3. 基(jī)因(yīn)工程載體(tǐ)的(dí)特點：
（一）都(dū)能獨立自主的復製(zhì)：載體DNA分子中有(yǒu)一(yī)段(duàn)不影響它們擴(kuò)增的非必需(xū)區域，如MCS，插(chā)在(zài)其中(zhōng)的(dí)外源DNA段，能被(bèi)動的(dí)跟(gēn)著載體(tǐ)一(yī)起(qǐ)復(fù)製/擴(kuò)增(zēng)，就(jiù)像(xiàng)載體(tǐ)的正(zhèng)常成分(fēn)一(yī)樣。
（二(èr)）都(dū)能(néng)便利的加以(yǐ)檢(jiǎn)測(cè)：如(rú)載體的藥(yào)物抗(kàng)性基(jī)因，多(duō)是抗生素抗(kàng)性基(jī)因(yīn)，將受體細(xì)胞(bāo)放在含有該抗生素培(péi)養(yǎng)板上(shàng)培養生(shēng)長(cháng)時，隻有(yǒu)攜帶(dài)這些(xiē)抗性基因的載體(tǐ)分子的受體細(xì)胞才(cái)能存活。
（三(sān)）都(dū)能容易(yì)進入(rù)宿(sù)主細(xì)胞中去(qù)，也(yě)易從(cóng)宿(sù)主細胞中分(fēn)離(lí)純化出來。


4. 載體的選擇和製(zhì)備：
選(xuǎn)擇載體主(zhǔ)要(yào)依(yī)據構建(jiàn)的(dí)目的(dí)，同時要考慮(lǜ)載(zǎi)體中應(yīng)有合(hé)適(shì)的限(xiàn)製酶切位點。如果構(gòu)建(jiàn)的(dí)目的是(shì)要(yào)表達一(yī)個特(tè)定的基因，則(zé)要選擇合適的(dí)表達載體。
載(zǎi)體選擇主要考慮(lǜ)下述(shù)3點：
【1】構建(jiàn)DNA重組(zǔ)體的目(mù)的，克隆擴(kuò)增(zēng)/表達表(biǎo)達(dá)，選擇合適(shì)的(dí)克隆(lóng)載體/表達載體(tǐ)。
【2】.載體(tǐ)的(dí)類(lèi)型(xíng)：
（1）克(kè)隆載(zǎi)體的(dí)克(kè)隆能(néng)力－據克(kè)隆(lóng)片(piàn)段大小（大(dà)選大(dà)，小選小）。如(rú)<10kb選質(zhì)粒(lì)。
（2）表(biǎo)達載體據受(shòu)體(tǐ)細胞(bāo)類型－原核(hé)/真核/穿梭，E.coli/哺乳(rǔ)類(lèi)細(xì)胞表(biǎo)達(dá)載(zǎi)體。
（3）對(duì)原核(hé)表達載體(tǐ)應(yīng)該注(zhù)意(yì)3點(diǎn)：
①選擇合(hé)適的(dí)啟(qǐ)動子及相應(yīng)的受體菌(jūn)；
②用於表(biǎo)達真核蛋(dàn)白質時注(zhù)意(yì)克服4個(gè)困難(nán)和閱讀(dú)框錯位；
③表(biǎo)達天然(rán)蛋白質或(huò)融合(hé)蛋白(bái)作(zuò)為相應載(zǎi)體的(dí)參考(kǎo)。
【3】載體MCS中的酶(méi)切位(wèi)點(diǎn)數與(yǔ)組(zǔ)成方(fāng)向(xiàng)因載體(tǐ)不同而異，適(shì)應目的(dí)基(jī)因與載(zǎi)體(tǐ)易(yì)於(yú)鏈(liàn)接(jiē)，不產生閱(yuè)讀(dú)框(kuàng)架錯(cuò)位(wèi)。
選(xuǎn)用質粒(lì)（zui常(cháng)用）做(zuò)載體的(dí)4點要求：
①選分子量小的(dí)質粒，即小載(zǎi)體（1－1.5kb）→不易(yì)損壞，在細菌裏麵(miàn)拷貝(bèi)數也(yě)多（也有(yǒu)大載(zǎi)體）；
②一般使(shǐ)用(yòng)鬆弛(chí)型(xíng)質(zhì)粒在細菌裏擴增不受約束，一(yī)般10個以上(shàng)的(dí)拷貝(bèi)，而(ér)嚴謹型(xíng)質(zhì)粒<10個。
③必(bì)需具備一個以上(shàng)的(dí)酶(méi)切(qiē)位點，有(yǒu)選擇(zé)的(dí)餘地；
④必需(xū)有(yǒu)易(yì)檢測的(dí)標記，多是(shì)抗生素的抗性(xìng)基因，不特(tè)指(zhǐ)多(duō)位(wèi)Ampr（試(shì)一試(shì)）。