RNAi的(dí)應用前景(jǐng)

RNAi的應用前景
 

 RNAi 技術(shù)中(zhōng)的相關問題主(zhǔ)要涉及(jí)以下幾點：
 
     （1） dsRNA 序(xù)列的(dí)選(xuǎn)擇dsRNA 主要(yào)選(xuǎn)自已(yǐ)知的cDNA 的開放閱(yuè)讀(dú)框架（ORF） 中的基因區(qū)域。為防止mRNA 調控蛋白對RISC 與靶(bǎ)RNA 結合的幹擾(rǎo),應(yīng)避(bì)免選擇包(bāo)括:1） 起始(shǐ)密(mì)碼子下遊(yóu)或終止密碼(mǎ)的(dí)50～100 核(hé)苷酸位置(zhì)以內(nèi)的區域(yù);2） 5′或3′端的(dí)非(fēi)翻(fān)譯(yì)區(qū)域;3） 內(nèi)含子區域(yù)。此(cǐ)外(wài),序列(liè)選(xuǎn)擇時也(yě)應避(bì)開(kāi)多(duō)聚(jù)鳥(niǎo)苷(gān)酸(suān)序(xù)列(liè)區（ ≥3 個(gè)） ,因為這樣(yàng)容易(yì)形(xíng)成四聚(jù)體結構(gòu), 抑製(zhì)RNAi 作用(yòng)。選(xuǎn)擇(zé)與靶(bǎ)mRNA 上序(xù)列互(hù)補的21～23 個(gè)核(hé)苷酸長度的片(piàn)段(duàn),以(yǐ)AA 開(kāi)頭為佳(jiā),因(yīn)為此(cǐ)法能簡(jiǎn)化(huà)dsRNA 合成過程(chéng),降低成本(běn),而(ér)且(qiě)合成(chéng)的dsRNA 能更好地(dì)抵抗RNA 酶的降解(jiě)。另外(wài),盡(jìn)量使dsRNA 序列中的GC含(hán)量(liáng)接(jiē)近50 %（45 %～55 %*） ,高(gāo)GC 含量(liáng)能明(míng)顯(xiǎn)降低基因沉(chén)默的效應。選擇前(qián)可以(yǐ)搜索BLAST數據庫,保證(zhèng)無其(qí)他與靶(bǎ)基因(yīn)同(tóng)源的基(jī)因(yīn)存在,避(bì)免(miǎn)引起對其他相(xiāng)似基因(yīn)的沉默作(zuò)用。並(bìng)不是所(suǒ)有(yǒu)的(dí)mRNA 均(jūn)對(duì)RNAi 敏感(gǎn)。為確(què)保靶(bǎ)基(jī)因(yīn)表達(dá)的有(yǒu)效抑製,同時(shí)合成兩個(gè)或以上的(dí)針對同(tóng)一基(jī)因的不(bù)同靶(bǎ)區域的(dí)dsRNA ;而(ér)且,標記(jì)dsRNA 正義鏈的3′端對RNAi 現(xiàn)象並沒(méi)有影(yǐng)響,現(xiàn)有(yǒu)的實驗尚未發現mRNA 的二級(jí)結構(gòu)對RNAi 有任(rèn)何顯著(zhù)的(dí)影(yǐng)響。目前(qián),RNAi 技術(shù)主(zhǔ)要以哺(bǔ)乳(rǔ)動物(wù)細(xì)胞為對(duì)象(xiàng)研(yán)究(jiū)其基因(yīn)的(dí)功能(néng)。但(dàn)> 30bp 的(dí)dsRNA 在(zài)哺乳動(dòng)物細胞(bāo)中會引(yǐn)起幹擾(rǎo)素(sù)樣效應,導致非(fēi)特(tè)異(yì)性(xìng)反應(yīng)。因而直接選(xuǎn)用(yòng)其(qí)下遊(yóu)的(dí)產物(wù)分(fēn)子siRNA 來(lái)代(dài)替,達(dá)到(dào)基因(yīn)研(yán)究(jiū)的(dí)目的。
 
     （2） dsRNA 的(dí)導(dǎo)入方法(fǎ)不同(tóng)的(dí)生物體可以選擇不同的(dí)方法。簡(jiǎn)單(dān)生物(wù),如單(dān)細胞生(shēng)物等,可(kě)選(xuǎn)用電(diàn)穿孔(kǒng)的方法; 較復(fù)雜生(shēng)物(wù)可(kě)選用dsRNA 微注射(shè)入生(shēng)殖(zhí)細胞或早期(qī)胚胎,綫蟲(chóng)也(yě)能采(cǎi)用(yòng)腸道(dào)或假體腔注(zhù)射(shè)的(dí)方法,與微(wēi)注射相比,RNAi 效率上(shàng)並(bìng)無顯著差別。還有浸(jìn)泡(pào)法(fǎ)，工程菌(jūn)喂養(yǎng)法，磷酸(suān)鈣共沉澱法等(děng)。若(ruò)使用的是化學法人工(gōng)合成(chéng)的(dí)siRNA（正義(yì)鏈和(hé)反義鏈） ,還(huán)要(yào)經(jīng)過退火過(guò)程(chéng),以(yǐ)雙鏈(liàn)的(dí)形式(shì)導入(rù)靶(bǎ)細胞。有人(rén)提(tí)出了以(yǐ)質(zhì)粒或病(bìng)毒(dú)為(wéi)載(zǎi)體(tǐ),通過轉導或轉(zhuǎn)染途徑(jìng),在(zài)細(xì)胞(bāo)內以DNA 為模板,利(lì)用(yòng)RNA 聚合(hé)酶Ⅲ,轉錄為siRNA（直接(jiē)形成雙鏈或(huò)通過(guò)回文(wén)序列折(zhē)疊後形成發夾結構） ,也能產生較明(míng)顯(xiǎn)的(dí)RNAi 效(xiào)應(yīng)。zui近,又有一(yī)種新(xīn)的(dí)導入(rù)方法(fǎ),就是借(jiè)助(zhù)高(gāo)壓水(shuǐ)槍(qiāng)的(dí)外(wài)力(lì)將構建(jiàn)的質粒直接自小鼠的尾(wěi)靜脈注入體內,觀察RNAi 在(zài)活(huó)體生物模型(xíng)而不(bù)是(shì)培養(yǎng)細胞上的基(jī)因沉(chén)默(mò)效應 ,但觀察到的(dí)siRNA 的半衰(shuāi)期較短,而(ér)且(qiě)由於使用了高壓(yā)的外力(lì),過(guò)程較(jiào)復雜,限製(zhì)了其在(zài)人(rén)類(lèi)疾病治(zhì)療方麵(miàn)的(dí)應(yīng)用(yòng)。而Pachuk 等則提出了肌(jī)注(zhù)的(dí)方法,將(jiāng)針(zhēn)對IL－12 的siRNA 的(dí)質粒表達載體導入(rù)小鼠體(tǐ)內(nèi),得到(dào)的RNAi 效(xiào)應更持久。

 
     （3） 發夾樣(yàng)結構(gòu)的siRNA實驗(yàn)證明(míng),發夾(jiā)樣(yàng)siRNA 能(néng)延(yán)長(cháng)在細(xì)胞(bāo)內(nèi)的(dí)作用(yòng)時間。此類(lèi)結構可(kě)由(yóu)具有回文(wén)序列的核(hé)苷酸鏈形成(chéng)。但(dàn)通常(cháng)回文結構不易獲得(dé),也(yě)可用頭碰(pèng)頭(tóu)的(dí)對(duì)稱序列來代替(tì)。轉錄(lù)發(fā)夾樣(yàng)siRNA 的模板必須(xū)與載體轉錄啟動子緊密(mì)相連(lián),而(ér)且盡(jìn)可(kě)能有zui短(duǎn)的(dí)多聚腺(xiàn)苷酸尾(wěi)巴,這樣(yàng)才(cái)能誘導的RNAi 效應(yīng)。Paddison 等提出類(lèi)似(sì)的結(jié)構(gòu)也可(kě)應用於(yú)長(cháng)片段dsRNA （500bp 左(zuǒ)右） ,而(ér)不(bù)會(huì)引(yǐn)起RNA 非特異(yì)性的(dí)降(jiàng)解。這為(wéi)檢測(cè)哺乳動物細胞中(zhōng)經過長期(qī)發(fā)育後(hòu)的(dí)基(jī)因(yīn)功(gōng)能提(tí)供了新的(dí)途(tú)徑。

 

    RNAi 的應(yīng)用領域(yù)及前景(jǐng)：RNAi 是(shì)一種的(dí)特異性(xìng)強的(dí)基因(yīn)阻(zǔ)斷技(jì)術(shù),近(jìn)年來發(fā)展(zhǎn)迅速,很(hěn)快(kuài)就(jiù)成為(wéi)功能基(jī)因組研究(jiū)的有力工(gōng)具。通(tōng)過(guò)實驗手(shǒu)段(duàn)將(jiāng)dsRNA 分(fēn)子導(dǎo)入(rù)細胞(bāo)內, 特異性地降解(jiě)細胞(bāo)內(nèi)與(yǔ)其(qí)序列同源(yuán)的(dí)mRNA ,封閉內源(yuán)性基因表達(dá),從反(fǎn)向遺傳(chuán)的(dí)角(jiǎo)度研究人類或其他生物(wù)基因組中(zhōng)未知基(jī)因(yīn)的(dí)功能。早(zǎo)期(qī)就有人(rén)應用此(cǐ)項(xiàng)技術分離了(liǎo)果蠅(yíng)胰島素(sù)信號轉導(dǎo)途徑(jìng)通路中的各種成分。近(jìn)來也(yě)有(yǒu)實驗報道(dào)通過RNAi 研(yán)究細胞內脂質(zhì)平衡(héng)過程中涉及(jí)的(dí)各(gè)條途徑。在(zài)這(zhè)之(zhī)前,曾(zēng)利用反(fǎn)義(yì)RNA 與靶(bǎ)mRNA 序(xù)列互補(bǔ)的特性來抑(yì)製(zhì)其(qí)表(biǎo)型的(dí)發生,但由於反(fǎn)義(yì)RNA對(duì)內源性(xìng)表達的(dí)基因抑製(zhì)作(zuò)用(yòng)較弱(ruò),往(wǎng)往(wǎng)會(huì)產生一些(xiē)過渡表型,易造(zào)成(chéng)對基(jī)因(yīn)功(gōng)能判斷(duàn)錯(cuò)誤(wù),目前已通過(guò)審批認(rèn)為(wéi)臨床上具有治療(liáo)作用(yòng)的(dí)僅有一種藥物———Vitravene 。RNAi 技術與之(zhī)相比,特異(yì)性更(gēng)高,作(zuò)用更(gēng)迅速(sù),副反應小(xiǎo),在(zài)有(yǒu)效地沉(chén)默靶基因(yīn)的(dí)同(tóng)時,對(duì)細(xì)胞本身的(dí)調(tiáo)控(kòng)係統(tǒng)也沒(méi)有影(yǐng)響。zui近在人類體細胞裏(lǐ)已經成(chéng)功地對(duì)近(jìn)20 種基因功能進行了“敲(qiāo)除”,尤(yóu)其是因此而了解了人類(lèi)空(kōng)泡蛋白(bái)Tsg101 對(duì)HIV 在人(rén)體(tǐ)內增(zēng)殖(zhí)的(dí)作(zuò)用,進一步深(shēn)化(huà)了(liǎo)對HIV 的研究。Leonid 等以(yǐ)脊(jǐ)髓(suǐ)灰質(zhì)炎(yán)病毒為模(mó)型,利(lì)用RNAi 來(lái)誘導細胞(bāo)的胞(bāo)內(nèi)免(miǎn)疫,產(chǎn)生(shēng)抗(kàng)病(bìng)毒(dú)效應,尤其是(shì)針(zhēn)對RNA 病(bìng)毒(dú)。對(duì)於(yú)易突(tū)變的病毒,可(kě)設(shè)計多種(zhǒng)靶向病(bìng)毒基因(yīn)保守序(xù)列的dsRNA ,減少(shǎo)它(tā)對dsRNA 的抵抗(kàng)。Maen 等(děng)也應用RNAi 技(jì)術(shù)成(chéng)功地阻斷了(liǎo)MCF－7 乳(rǔ)腺癌細(xì)胞中一(yī)種(zhǒng)異(yì)常表(biǎo)達的與(yǔ)細胞增殖(zhí)分化相(xiāng)關(guān)的(dí)核轉錄(lù)因子(zǐ)基因(yīn)Sp21 的功(gōng)能(néng)。RNAi 技(jì)術(shù)的(dí)應用,不僅能大大(dà)推動(dòng)人(rén)類後基因組(zǔ)計劃（蛋白組(zǔ)學(xué)） 的(dí)發展,還(huán)有(yǒu)可(kě)能(néng)設計(jì)出(chū)RNAi 芯片(piàn),高(gāo)通(tōng)量地篩(shāi)選藥物靶基因,逐(zhú)條檢(jiǎn)測人(rén)類(lèi)基(jī)因(yīn)組(zǔ)的(dí)表(biǎo)達(dá)抑製情況來(lái)明(míng)確基(jī)因(yīn)的(dí)功能(néng),並(bìng)且它還將(jiāng)應(yīng)用於基(jī)因治(zhì)療(liáo)，新藥開發，生物(wù)醫學研(yán)究等(děng)領(lǐng)域,用RNAi 技(jì)術來(lái)抑(yì)製基因的(dí)異(yì)常(cháng)表(biǎo)達,為(wéi)治療癌症(zhèng)，遺傳病(bìng)等疾病開辟(bì)了(liǎo)新(xīn)的途(tú)徑。