上海(hǎi)RNA操(cāo)作步驟(zhòu):

　　1. 匀(yún)漿處理:

　　a.組織(zhī) 將組織(zhī)在(zài)液氮中磨碎(suì),每(měi)50-100mg組織加入1ml TRIzol,用(yòng)匀漿儀進(jìn)行匀(yún)漿處(chǔ)理(lǐ)。樣(yàng)品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

　　b.單層培(péi)養細(xì)胞 直(zhí)接在(zài)培養(yǎng)板中加入TRIzol裂(liè)解細(xì)胞(bāo)，每10cm2麵積(jī)（即(jí)3.5cm直(zhí)徑的(dí)培養(yǎng)板）加(jiā)1ml，用移液器(qì)吸打(dǎ)幾次(cì)。TRIzol的(dí)用量應(yīng)根(gēn)據培(péi)養板(bǎn)麵(miàn)積(jī)而(ér)定，不(bù)取決(jué)於細胞(bāo)數。TRIzol加(jiā)量不(bù)足(zú)可能導(dǎo)致提(tí)取的(dí)RNA有DNA汙(wū)染。

　　c．細(xì)胞(bāo)懸液 離心(xīn)收(shōu)集(jí)細(xì)胞(bāo)，每5-10×106動物，植物(wù)，酵母細(xì)胞或1×107細菌(jūn)細胞(bāo)加入(rù)1ml TRIzol，反(fǎn)復(fù)吸(xī)打(dǎ)。加(jiā)TRIzol之前(qián)不要洗(xǐ)滌細(xì)胞以免mRNA降解。一(yī)些(xiē)酵(jiào)母和細菌細胞需(xū)用匀漿儀處理。

　　上海(hǎi)RNA將匀漿樣(yàng)品(pǐn)在(zài)室(shì)溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋(dàn)白復合物*分離。

　　1．可(kě)選(xuǎn)步(bù)驟：如樣(yàng)品中(zhōng)含(hán)有較多蛋(dàn)白質(zhì)，脂(zhī)肪(fáng)，多糖(táng)或胞外(wài)物質(zhì)（肌肉(ròu)，植(zhí)物結(jié)節部(bù)分(fēn)等(děng)）可於2-8℃10000×g離心10分鐘(zhōng)，取上清(qīng)。離心得到(dào)的(dí)沉澱中包括細胞外膜(mó)，多糖(táng)，高(gāo)分(fēn)子量DNA，上(shàng)清(qīng)中含有RNA。處(chǔ)理脂(zhī)肪組織時(shí)，上層(céng)有(yǒu)大(dà)量油脂應去(qù)除。取(qǔ)澄(chéng)清的(dí)匀漿(jiāng)液(yè)進行(háng)下一步操作。

　　2. 2-8℃10000×g離心(xīn)15分鐘(zhōng)。樣品分為(wéi)三(sān)層：底(dǐ)層(céng)為黃色有(yǒu)機相，上層(céng)為(wéi)無色水(shuǐ)相和一(yī)個中間層(céng)。RNA主要(yào)在水相(xiāng)中(zhōng)，水相體積約為所用(yòng)TRIzol試劑(jì)的60℅。

　. 把水相(xiāng)轉移(yí)到(dào)新管(guǎn)中(zhōng)，如要分離(lí)DNA和(hé)蛋(dàn)白質可保留有機相，進一步(bù)操作(zuò)見後。用異丙醇沉澱(diàn)水相中的RNA。每(měi)使(shǐ)用1ml TRIzol加入(rù)0.5ml異丙(bǐng)醇，室溫放置10分鐘。

　　1. 2-8℃10000×g離(lí)心10分(fēn)鐘(zhōng)，離(lí)心前看不出(chū)RNA沉(chén)澱，離(lí)心後(hòu)在(zài)管側(cè)和管底出現膠狀沉澱(diàn)。移(yí)去上清。

　2. 用75℅乙(yǐ)醇洗滌(dí)RNA沉(chén)澱(diàn)。每使用(yòng)1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇(chún)。2-8℃不(bù)超過(guò)7500×g離(lí)心(xīn)5分鐘，棄(qì)上(shàng)清。

　　3.室溫放置幹燥或(huò)真空(kōng)抽幹(gān)RNA沉澱，大(dà)約晾5-10分鐘即(jí)可.不要真空離心(xīn)幹(gān)燥，過於幹燥(zào)會導致RNA的(dí)溶解性(xìng)大(dà)大降(jiàng)低(dī)。加入(rù)25-200μl無RNase的(dí)水(shuǐ)或0.5℅SDS,用(yòng)槍(qiāng)頭吸打(dǎ)幾(jī)次,55-60℃放置(zhì)10分鐘使RNA溶解.如(rú)RNA用於酶(méi)切反(fǎn)應(yīng),勿使用SDS溶(róng)液。RNA也(yě)可(kě)用100℅的去離子甲(jiǎ)酰(xiān)胺溶(róng)解，-70℃保存。