TA克隆實(shí)驗原(yuán)理　

  TA克隆是(shì)利(lì)用耐熱聚合(hé)酶(méi)，如(rú)Taq聚(jù)合(hé)酶(méi)，Tfl，Tth等具有末端(duān)轉(zhuǎn)移酶活性(xìng)，而不具(jù)有3 一5外(wài)切酶的校(xiào)準(zhǔn)活性(xìng)，即在(zài)PCR產物的兩個3 末端加(jiā)上(shàng)未配對的單(dān)一(yī)A凸出(chū)尾(wěi) ，質粒載體提供(gōng)綫(xiàn)性(xìng)3末端單一的(dí)T凸出(chū)尾，使(shǐ)該(gāi)載體(tǐ)能夠直接(jiē)與PCR產(chǎn)物(wù)高效連接(jiē)。技(jì)術(shù)比(bǐ)其(qí)它PCR克(kè)隆方法有更(gēng)高的重組效率(shuài)。

隻需4個步(bù)驟
：①擴增(zēng)目的PCR產物(wù)；②製備(bèi)T克隆載體(tǐ)；③PCR產物(wù)直接(jiē)克(kè)隆至(zhì)T載體上④轉化(huà)並(bìng)篩選(xuǎn)重組子(zǐ)。

實驗(yàn)步驟

（1）擴增後的PCR產物(wù)與(yǔ)T載(zǎi)體(tǐ)的(dí)連接(jiē)

取1隻(zhī)無(wú)菌Ep管，用微量進樣(yàng)器(qì)按下(xià)列(liè)順(shùn)序加入各(gè)成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

PCR產物(wù)約(yuē)0.3 pmol

T載體(tǐ)約(yuē)0.03pmol

T4 DNA Ligase 1ul

ddH2O 加至(zhì) 25ul

*1 DNA的(dí)摩爾數應控(kòng)製在載(zǎi)體(tǐ)DNA摩爾數(shù)的(dí)3－10倍。

*2 相同(tóng)末(mò)端的(dí)載(zǎi)體(tǐ)與DNA進(jìn)行連(lián)接(jiē)時(shí)，應首先(xiān)將載(zǎi)體(tǐ)進行(háng)去(qù)磷酸(suān)化處理(lǐ)，以(yǐ)防止其(qí)自身(shēn)環(huán)化。

（2）蓋好(hǎo)蓋(gài)子，用(yòng)手指輕(qīng)彈Ep管(guǎn)數(shù)次(cì)，並於台(tái)式離(lí)心(xīn)機離心2s 以集中(zhōng)溶液。

（3）將(jiāng)反應(yīng)管(guǎn)放入4℃金屬(shǔ)浴(yù)中反應(yīng)20h。

（4）取出約2ul的DNA連接液(yè)進行(háng)瓊(qióng)脂糖凝膠電(diàn)泳，鑒(jiàn)定連接結果，與未(wèi)經連接(jiē)的(dí)質粒DNA和酶(méi)切DNA一同作電(diàn)泳。

（5）用0.1×TE將連接混合(hé)物(wù)稀釋(shì)至(zhì)50ul，使用10ul轉(zhuǎn)化(huà)大(dà)腸(cháng)杆菌(jūn)感受(shòu)態細胞。

（6）通過Amp抗性來篩選(xuǎn)轉化子，轉(zhuǎn)化子(zǐ)擴增(zēng)後(hòu)，可(kě)將轉(zhuǎn)化的質粒(lì)提取出，進(jìn)行電泳(yǒng)，酶切等進(jìn)一步(bù)鑒定。