簡述DNA甲(jiǎ)基(jī)化(huà)檢測(cè)

    是哺乳類(lèi)動物一個(gè)重(zhòng)要的基因外遺傳信號。有研(yán)究表明,DNA甲基(jī)化(huà)與(yǔ)大(dà)多數腫瘤的發生相關,抑癌(ái)基因(yīn)啟動子CpG島(dǎo)的(dí)高(gāo)度(dù)甲(jiǎ)基(jī)化可(kě)引起(qǐ)抑(yì)癌基因(yīn)表(biǎo)達沉默，細胞出現無節製生長,導致腫瘤(liú)的(dí)發(fā)生。目前，基因的甲(jiǎ)基(jī)化研究主(zhǔ)要(yào)結合亞硫(liú)酸(suān)氫(qīng)鈉處(chǔ)理和PCR技術，分為(wéi)甲基化特(tè)異(yì)性(xìng)PCR（Methylation specific PCR,MSP）和(hé)硫化測序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP）。 

 

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     雙鏈DNA變(biàn)性(xìng)解鏈(liàn)後，在(zài)HSO3-作用下發(fā)生C→U轉(zhuǎn)化，C若已有(yǒu)甲基化則(zé)無(wú)此改(gǎi)變(biàn)
；甲(jiǎ)基(jī)化(huà)修飾隻(zhī)發生(shēng)於5′→3′方(fāng)向C-G相聯結(jié)構的C上，因此(cǐ)在(zài)HSO3-作(zuò)用後，DNA CpG島(dǎo)若(ruò)無(wú)甲(jiǎ)基(jī)化，則序列中的(dí)改(gǎi)變(biàn)為(wéi)C→U，CG→UG，若(ruò)有甲基(jī)化(huà)則(zé)為C→U，CG→CG，用(yòng)不同的引(yǐn)物做PCR，即可(kě)檢測(cè)出這種差異，從而確定(dìng)基因有無CpG島甲基(jī)化。從(cóng)理(lǐ)論上(shàng)說，DNA發生甲基化的(dí)MSP產(chǎn)物的序列與原序(xù)列比(bǐ)較(jiào)，變(biàn)化為(wéi)C→T，CG→CG，相應其互補(bǔ)鏈的改變(biàn)為G→A，CG→CG。然(rán)後設(shè)計針對甲(jiǎ)基(jī)化(huà)和(hé)非(fēi)甲基化序列(liè)的(dí)引物並進(jìn)行聚(jù)合酶(méi)鏈(liàn)反應(yīng)（PCR）擴增，zui後通(tōng)過瓊(qióng)脂(zhī)糖(táng)凝膠(jiāo)電(diàn)泳分析(xī)，確定與(yǔ)引物互補的DNA序(xù)列(liè)的(dí)甲(jiǎ)基(jī)化(huà)狀態。MSP法靈敏度較高(gāo)，應用範圍廣。

 

    結合(hé)重(zhòng)亞(yà)硫酸(suān)鹽的(dí)測序法是(shì)一種靈敏的(dí)能直接檢測(cè)分(fēn)析基(jī)因(yīn)組(zǔ)DNA甲基(jī)化(huà)模式的方(fāng)法。重亞硫酸(suān)鹽處理(lǐ)後，用針(zhēn)對改變(biàn)後的(dí)DNA序(xù)列設(shè)計特異(yì)性引物並進(jìn)行聚(jù)合(hé)酶鏈(liàn)式(shì)反(fǎn)應(yīng)（PCR）。 PCR產(chǎn)物中(zhōng)原先非(fēi)甲基(jī)化的胞嘧啶(dìng)位點被胸腺嘧(mì)啶(dìng)所替代(dài)，而甲基化的胞嘧啶位點保持(chí)不變(biàn)。PCR產物克隆後進行(háng)測(cè)序。通過(guò)這個(gè)方(fāng)法(fǎ)能(néng)得到特(tè)定(dìng)位點在各個(gè)基(jī)因組(zǔ)DNA分子中的甲(jiǎ)基化狀態(tài)。

 

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1）   根據(jù)目的基因啟動子序(xù)列設(shè)計相(xiāng)應引(yǐn)物(wù)
；
2）   基因組(zǔ)DNA的提取和定(dìng)量(liáng)
；
3）   亞硫(liú)酸(suān)氫鈉修飾(shì)基(jī)因組(zǔ)DNA
；
4）   修(xiū)飾(shì)後DNA純化(huà)回收
；
5）   a，結合(hé)實時(shí)定(dìng)量(liáng)PCR的qMSP
；
        b，BSP，對(duì)PCR產物進(jìn)行測(cè)序(xù)並與(yǔ)未經(jīng)處(chǔ)理的(dí)序(xù)列比較
；
6）   數(shù)據處理
；
7）   向(xiàng)客(kè)戶(hù)提交數(shù)據分析結(jié)果(guǒ)與實(shí)驗報告。

 

樣(yàng)品(pǐn)要求(qiú)：

    盡可(kě)能新鮮和足量的(dí)組(zǔ)織（≥50mg），細(xì)胞(bāo)樣(yàng)品(pǐn)（≥106）或全(quán)血(xiě)（≥300μl），或直接(jiē)提(tí)供(gōng)純化(huà)好的DNA（≥5μg/樣品）。

 

    甲(jiǎ)基(jī)化是在(zài)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催(cuī)化作用(yòng)下, 利用(yòng)S-腺苷甲硫氨(ān)酸（S-adenosylmethionine, SAM）提供甲(jiǎ)基，在(zài)CpG二(èr)核苷酸中胞(bāo)嘧啶嘧啶環的五號(hào)碳原子上加(jiā)上甲基的(dí)共(gòng)價修飾過程.

    DNA甲基化是(shì)表(biǎo)觀(guān)遺傳(chuán)修(xiū)飾的主要(yào)方式，它不(bù)改變DNA的(dí)一級結(jié)構(gòu)，卻(què)在(zài)細胞的發育，基(jī)因的表達，及基(jī)因組(zǔ)的穩(wěn)定性(xìng)中起(qǐ)著重要的(dí)作用。

    CpG島(dǎo)的(dí)高甲基(jī)化(huà)是腫瘤中存在(zài)的普遍現象(xiàng)，而啟(qǐ)動子(zǐ)CpG 島的高(gāo)甲基化是(shì)除突(tū)變和缺失外腫瘤中抑(yì)癌(ái)基因失活的第三種機製。

    因(yīn)此，基因啟動(dòng)子(zǐ)甲基(jī)化檢(jiǎn)測(cè)在臨床診斷（如(rú)甲基(jī)化檢測與(yǔ)低劑量CT相(xiāng)結(jié)合），藥物敏(mǐn)感性檢測等方麵具有很(hěn)高(gāo)的(dí)應用(yòng)價值。

    目前甲基化特異(yì)性(xìng)PCR（Methylmion Specific PCR，MSP）及其改(gǎi)進方(fāng)法是檢測基(jī)因甲基(jī)化的(dí)經典方(fāng)法(fǎ)．MSP法(fǎ)的(dí)原理是首(shǒu)先(xiān)用(yòng)亞硫(liú)酸(suān)氫鈉修(xiū)飾(shì)處(chǔ)理基(jī)因組DNA，所有未發生甲基化(huà)的胞嘧啶(dìng)都(dū)被轉(zhuǎn)化(huà)為(wéi)尿(niào)嘧啶，而甲基(jī)化的(dí)胞嘧(mì)啶則(zé)不變(biàn)。然(rán)後設計針對(duì)甲基化和(hé)非甲基化(huà)序列(liè)的(dí)引物並進行聚(jù)合(hé)酶鏈反應（PCR）擴(kuò)增，zui後通過(guò)瓊(qióng)脂糖(táng)凝膠電泳分(fēn)析(xī)，確(què)定與引(yǐn)物互補(bǔ)的DNA序列的(dí)甲基化狀態。