siRNA幹(gān)擾載體構(gòu)建(jiàn)與(yǔ)引(yǐn)物設計

 

siRNA幹(gān)擾載體(tǐ)構(gòu)建(jiàn)與(yǔ)引(yǐn)物設計(jì)

 

siRNA幹(gān)擾載(zǎi)體(tǐ)構(gòu)建過程中(zhōng)，針(zhēn)對(duì)siRNA設計(jì)的(dí)引物是怎麼(mó)設計的(dí)?

一般是合成(chéng)一對引物(wù)，然(rán)後退火(huǒ)，再(zài)與綫(xiàn)性(xìng)化的載體做連(lián)接(jiē)。由於引(yǐn)物比(bǐ)較長，所以合成時一般(bān)都會有(yǒu)比(bǐ)較(jiào)多的鹼基(jī)突(tū)變，因(yīn)此，做(zuò)shRNA表達載體構建的主(zhǔ)要(yào)難(nán)度，在於篩(shāi)選出正(zhèng)確的(dí)克隆(lóng)，有時候可能要選(xuǎn)很多(duō)個克隆測序才能(néng)篩到想要的。具體(tǐ)的序(xù)列組(zǔ)成(chéng)，一(yī)般(bān)是sense-loop-antisense。不同(tóng)的公司會有不(bù)同(tóng)的(dí)設(shè)計(jì)原(yuán)則(zé)的。

經(jīng)驗(yàn)：我們一般(bān)不去(qù)考慮構建(jiàn)載體來(lái)得(dé)到siRNA！
載體(tǐ)表達(dá)siRNA方(fāng)法(fǎ)主要(yào)存在(zài)以下缺(quē)點(diǎn)：
1
，外源導(dǎo)入shRNA的表達(dá)會(huì)幹(gān)擾細胞本身miRNA的正(zhèng)常(cháng)表達(dá)，而(ér)miRNA在(zài)基因的(dí)表(biǎo)達調(tiáo)控(kòng)方(fāng)麵(miàn)有著至關(guān)重要的作用(yòng)，目前(qián)已經(jīng)證(zhèng)實很多疾病的(dí)產生通(tōng)miRNA的表達異常存在確(què)切(qiē)關係，已(yǐ)有(yǒu)很多(duō)文(wén)獻報道和(hé)證(zhèng)實(shí)；
2
，載(zǎi)體構建(jiàn)的周期長，操作(zuò)較(jiào)為(wéi)復雜(zá)，試驗(yàn)重(zhòng)復性(xìng)不(bù)好(hǎo)，做(zuò)過的人應(yīng)該(gāi)大多都(dū)知(zhī)道；
3
，載(zǎi)體(tǐ)用(yòng)於體內(nèi)試(shì)驗(yàn)的(dí)毒性(xìng)非常大，容易激發(fā)機(jī)體強烈的免疫(yì)應(yīng)答反(fǎn)應(yīng)，副(fù)作用大(dà)，已(yǐ)有(yǒu)多篇文(wén)獻證(zhèng)實；
4
，通量(liáng)低(dī)，影響因素(sù)更多(duō)，體(tǐ)內試驗(yàn)的效果很差，存在安全性的問(wèn)題；
5
，shRNA的表(biǎo)達在(zài)時(shí)間和表(biǎo)達(dá)量(liáng)上(shàng)都較難(nán)控製等。
這(zhè)也是為什(shí)麼(mó)現在10多(duō)種進(jìn)入(rù)臨(lín)床試驗(yàn)的(dí)RNAi藥物(wù)幾(jī)乎都(dū)是用化學(xué)合成(chéng)的siRNA來做的原(yuán)因！