上(shàng)海(hǎi)RNA提(tí)取原(yuán)理(lǐ):

    RNA可分為信使RNA，轉(zhuǎn)運RNA和(hé)核(hé)糖(táng)體(tǐ)RNA三大類(lèi)，不(bù)同(tóng)組織總(zǒng)RNA提取實質(zhì)就是將細胞裂解，釋放出RNA，並(bìng)通過(guò)不同方式去除蛋白，DNA等雜(zá)質，zui終(zhōng)獲得(dé)高(gāo)純RNA產物的過程。  由(yóu)於RNA樣品易受環(huán)境因(yīn)素(sù)特(tè)別是RNA酶(méi)的影響而(ér)降解，提取高(gāo)質(zhì)量的RNA樣(yàng)品在(zài)生命(mìng)科研中具(jù)有(yǒu)相當(dāng)的挑戰性。RNA提取對樣品(pǐn)的新(xīn)鮮性(xìng)要求非常高(gāo)，獲(huò)取(qǔ)樣(yàng)品後(hòu)立即提取(qǔ)RNA，若(ruò)無條(tiáo)件(jiàn)立(lì)即實驗，應保存(cún)於-80℃或液(yè)氮中。

上海(hǎi)RNA提(tí)取操作(zuò)步驟:

1. 匀漿(jiāng)處理:

   a.組織 將(jiāng)組織在液(yè)氮中(zhōng)磨(mó)碎(suì),每50-100mg組織加入(rù)1ml TRIzol,用匀漿儀進行匀(yún)漿(jiāng)處(chǔ)理。樣品(pǐn)體(tǐ)積不(bù)應(yīng)超(chāo)過(guò)TRIzol體(tǐ)積10℅。
   b.單層培養細胞 直(zhí)接在(zài)培養板中加入TRIzol裂(liè)解細胞(bāo)，每10cm2麵積(jī)（即(jí)3.5cm直徑的培養(yǎng)板）加1ml，用(yòng)移液器吸(xī)打(dǎ)幾(jī)次。TRIzol的用(yòng)量(liáng)應根據培養板麵(miàn)積而定(dìng)，不(bù)取決於細胞數(shù)。TRIzol加量(liáng)不足(zú)可能導(dǎo)致(zhì)提取的(dí)RNA有(yǒu)DNA汙染。
   c．細(xì)胞懸(xuán)液 離心(xīn)收集細胞，每5-10×106動物，植(zhí)物(wù)，酵(jiào)母細胞(bāo)或(huò)1×107細菌細(xì)胞加入(rù)1ml TRIzol，反(fǎn)復吸打(dǎ)。加(jiā)TRIzol之前不(bù)要(yào)洗(xǐ)滌細(xì)胞(bāo)以免(miǎn)mRNA降(jiàng)解。一(yī)些酵母和細(xì)菌(jūn)細胞(bāo)需用(yòng)匀漿儀處理(lǐ)。

2．將匀漿樣(yàng)品(pǐn)在室溫（15-30℃）放(fàng)置(zhì)5分鐘(zhōng)，使核酸(suān)蛋白(bái)復合(hé)物*分離。
3．可選步(bù)驟：如樣品中(zhōng)含有(yǒu)較(jiào)多(duō)蛋白(bái)質，脂(zhī)肪，多糖或胞(bāo)外物質（肌(jī)肉(ròu)，植物結節(jié)部分等）可於2-8℃10000×g離心(xīn)10分(fēn)鐘(zhōng)，取上(shàng)清。離心(xīn)得(dé)到的(dí)沉澱(diàn)中包括細胞外(wài)膜(mó)，多糖(táng)，高(gāo)分(fēn)子量DNA，上(shàng)清(qīng)中含有RNA。處理脂(zhī)肪(fáng)組織(zhī)時，上層有大(dà)量(liáng)油(yóu)脂(zhī)應(yīng)去除。取澄清(qīng)的匀漿液進行下(xià)一步操(cāo)作。
5. ，劇(jù)烈振(zhèn)蕩(dàng)15秒，室溫放(fàng)置3分(fēn)鐘。
6. 2-8℃10000×g離(lí)心(xīn)15分鐘(zhōng)。樣(yàng)品(pǐn)分為三(sān)層：底(dǐ)層(céng)為黃色(sè)有(yǒu)機相(xiāng)，上(shàng)層為(wéi)無色(sè)水相和一個中(zhōng)間層(céng)。RNA主要(yào)在水(shuǐ)相(xiāng)中，水相體積約為(wéi)所用(yòng)TRIzol試(shì)劑(jì)的(dí)60℅。
7. 把(bǎ)水相(xiāng)轉(zhuǎn)移到新(xīn)管(guǎn)中(zhōng)，如要分(fēn)離(lí)DNA和(hé)蛋白(bái)質可保留(liú)有(yǒu)機(jī)相，進(jìn)一(yī)步(bù)操(cāo)作見後(hòu)。用異(yì)丙(bǐng)醇(chún)沉澱(diàn)水(shuǐ)相中的RNA。每使(shǐ)用1ml TRIzol加入(rù)0.5ml異(yì)丙醇，室溫放(fàng)置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘(zhōng)，離心前(qián)看不(bù)出RNA沉澱，離心後在管(guǎn)側(cè)和管(guǎn)底出(chū)現膠狀(zhuàng)沉(chén)澱(diàn)。移去(qù)上(shàng)清(qīng)。
9. 用(yòng)75℅乙醇洗滌RNA沉澱(diàn)。每(měi)使用(yòng)1ml TRIzol至(zhì)少加1ml 75℅乙(yǐ)醇。2-8℃不(bù)超過7500×g離心5分鐘，棄上清(qīng)。
10.室(shì)溫(wēn)放置幹燥(zào)或真空抽幹RNA沉澱(diàn)，大約(yuē)晾(liàng)5-10分鐘(zhōng)即(jí)可(kě).不(bù)要真空離(lí)心幹燥，過於幹燥(zào)會(huì)導致RNA的溶(róng)解性大大降(jiàng)低。加(jiā)入(rù)25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用(yòng)槍頭(tóu)吸打幾次,55-60℃放置(zhì)10分鐘(zhōng)使RNA溶解(jiě).如(rú)RNA用於酶切反應(yīng),勿(wù)使用SDS溶(róng)液。RNA也可(kě)用100℅的(dí)去離(lí)子(zǐ)甲酰胺溶(róng)解，-70℃保(bǎo)存(cún)。

注(zhù)意事項(xiàng)：
    1.從(cóng)少量樣品（1-10mg組織或(huò)102-104細(xì)胞）中提取(qǔ)RNA時(shí)可(kě)加入少許(xǔ)糖原(yuán)以(yǐ)促進(jìn)RNA沉(chén)澱。例(lì)如加800ml TRIzol匀(yún)漿樣品(pǐn)，沉澱RNA前加(jiā)5-10μg RNase-free糖原(yuán)。糖(táng)原(yuán)會(huì)與(yǔ)RNA一同沉澱(diàn)出(chū)來(lái)，糖(táng)原濃度不高(gāo)於(yú)4mg/ml是(shì)不(bù)影(yǐng)響*鏈(liàn)的(dí)合(hé)成(chéng)，也(yě)不影(yǐng)響PCR反(fǎn)應。
   2．之前(qián)樣品(pǐn)可(kě)以在(zài)-60至(zhì)-70℃保(bǎo)存(cún)至(zhì)少(shǎo)一個月。RNA沉(chén)澱可(kě)以(yǐ)保存(cún)於(yú)75% 酒精(jīng)中2-8℃一星期以上(shàng)或-5至-20℃一年(nián)以(yǐ)上(shàng)。
   3．分層和(hé)RNA沉(chén)澱時也可使用台(tái)式離(lí)心機(jī)，2600×g離(lí)心(xīn)30-60分鐘。
預期產量(liáng)：1mg組織或(huò)1×106細(xì)胞(bāo)提取RNA分別(bié)為(wéi)：
肝和(hé)脾(pí)6-10μg ,腎(shèn)3-4μg ,骨(gǔ)骼肌和腦組織1-1.5μg ,胎盤1-4μg ,上(shàng)皮細(xì)胞(bāo)8-15μg ,成(chéng)纖維細胞5-7μg 。

常見問題(tí)分(fēn)析：
1.得(dé)率(shuài)低：A.樣(yàng)品裂解(jiě)或匀漿處(chǔ)理(lǐ)不*

B．RNA沉(chén)澱(diàn)未*溶解
2.RNA提(tí)取後(hòu)A260/A280<1.65 ：

A.檢(jiǎn)測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒(méi)有(yǒu)溶於水，而(ér)溶於了TE中(zhōng)。低離子濃度(dù)和低(dī)pH值條(tiáo)件下(xià)A280值偏(piān)高(gāo)
B．樣品(pǐn)匀漿(jiāng)時(shí)加的(dí)試劑(jì)量太(tài)少(shǎo)
C．匀漿樣(yàng)品時未在室溫放置(zhì)5分鐘
D．吸(xī)取(qǔ)水(shuǐ)相時混(hùn)入了有機相
E．RNA沉(chén)澱未*溶(róng)解。
3.RNA降解：

A.組織(zhī)取出(chū)後沒有馬上(shàng)處理或冷凍(dòng)
B.待提取RNA的(dí)樣品沒有(yǒu)保存於-60至(zhì)-70℃,而(ér)保存在(zài)了-5至-20℃
C.細胞在用胰(yí)酶(méi)處理時過度
D.溶(róng)液(yè)或(huò)離(lí)心(xīn)管未經(jīng)RNase去除(chú)處理(lǐ)
E.電泳(yǒng)時使(shǐ)用的(dí)甲醛(quán)pH值低於了(liǎo)3.5
4.DNA汙(wū)染:

A. 樣(yàng)品匀(yún)漿時(shí)加(jiā)的試(shì)劑量(liáng)太少
B.樣品(pǐn)中含(hán)有有機溶劑（如乙醇,DMSO等）,強(qiáng)緩衝液或鹼(jiǎn)性(xìng)溶液(yè)
5.蛋白聚糖(táng)和多糖汙染:

沉(chén)澱RNA的(dí)過程中(zhōng)作(zuò)以(yǐ)下(xià)改進(jìn)可去(qù)除(chú)這些汙染，步(bù)驟7中,每使用(yòng)1ml TRIzol在水相(xiāng)中(zhōng)加0.25ml異(yì)丙(bǐng)醇(chún)和0.25ml高鹽(yán)溶液（0.8M檸檬(méng)酸鈉和1.2M NaCl）混合離心,按之(zhī)前(qián)操(cāo)作進行。這種(zhǒng)方法(fǎ)可使蛋(dàn)白聚糖和(hé)多(duō)糖留(liú)在(zài)溶(róng)液(yè)中(zhōng)，高效沉澱(diàn)出純(chún)RNA。從含(hán)有大量(liáng)多糖的(dí)植(zhí)物中(zhōng)提取RNA時應在(zài)匀漿後離(lí)心(xīn)，並(bìng)加上(shàng)以(yǐ)上(shàng)操(cāo)作步驟。