RNA提(tí)取原(yuán)理(lǐ):

    RNA可分(fēn)為(wéi)信使(shǐ)RNA，轉運RNA和核(hé)糖體RNA三(sān)大(dà)類(lèi)，不同組(zǔ)織(zhī)總RNA提取(qǔ)實質就是將(jiāng)細(xì)胞裂解，釋(shì)放出(chū)RNA，並(bìng)通過不同方式去(qù)除蛋白(bái)，DNA等(děng)雜(zá)質(zhì)，zui終(zhōng)獲得(dé)高(gāo)純(chún)RNA產物(wù)的過(guò)程。  由於(yú)RNA樣品易受環境(jìng)因(yīn)素(sù)特(tè)別(bié)是RNA酶(méi)的影(yǐng)響而(ér)降解(jiě)，提(tí)取(qǔ)高質量的RNA樣品(pǐn)在生命(mìng)科研(yán)中具有相當的挑(tiāo)戰(zhàn)性。對(duì)樣品的新(xīn)鮮性(xìng)要(yào)求非(fēi)常(cháng)高，獲取樣(yàng)品後立(lì)即提取(qǔ)RNA，若無條件立(lì)即實驗(yàn)，應保(bǎo)存於-80℃或(huò)液氮中(zhōng)。

試劑(jì)：

    TRIzol，氯(lǜ)仿(fǎng)，異丙醇，75℅乙醇(chún)，無RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需(xū)用DEPC處(chǔ)理過的水配製）

操(cāo)作步(bù)驟:
1. 匀漿處(chǔ)理:

   a.組(zǔ)織 將組織(zhī)在(zài)液氮(dàn)中磨碎,每(měi)50-100mg組織加入(rù)1ml TRIzol,用匀漿儀進(jìn)行(háng)匀漿處(chǔ)理。樣品體(tǐ)積(jī)不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。
   b.單層(céng)培(péi)養細(xì)胞(bāo) 直接(jiē)在(zài)培養板中(zhōng)加入TRIzol裂解細胞(bāo)，每10cm2麵積(jī)（即(jí)3.5cm直(zhí)徑的培(péi)養(yǎng)板）加(jiā)1ml，用(yòng)移(yí)液器吸(xī)打(dǎ)幾次。TRIzol的用量(liáng)應根據培養板(bǎn)麵積(jī)而定，不取(qǔ)決於細胞(bāo)數。TRIzol加量不足可(kě)能(néng)導(dǎo)致(zhì)提(tí)取的RNA有DNA汙(wū)染。
   c．細胞懸(xuán)液 離心收集(jí)細(xì)胞(bāo)，每5-10×106動(dòng)物(wù)，植(zhí)物(wù)，酵(jiào)母細(xì)胞或1×107細菌(jūn)細胞加(jiā)入(rù)1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前(qián)不要(yào)洗(xǐ)滌(dí)細胞以免mRNA降(jiàng)解(jiě)。一些酵母和(hé)細菌細(xì)胞需(xū)用匀漿(jiāng)儀處理(lǐ)。

2．將匀漿樣(yàng)品在室(shì)溫(wēn)（15-30℃）放置5分(fēn)鐘，使核(hé)酸(suān)蛋白復(fù)合物(wù)*分離(lí)。
3．可(kě)選(xuǎn)步(bù)驟(zhòu)：如樣品(pǐn)中含有較(jiào)多(duō)蛋(dàn)白質，脂肪(fáng)，多糖或胞(bāo)外(wài)物質（肌肉(ròu)，植物結節部(bù)分等）可於2-8℃10000×g離心(xīn)10分(fēn)鐘(zhōng)，取(qǔ)上(shàng)清。離(lí)心(xīn)得到的沉澱(diàn)中包(bāo)括細(xì)胞(bāo)外(wài)膜(mó)，多糖，高(gāo)分子(zǐ)量DNA，上清中含(hán)有(yǒu)RNA。處理脂肪組織時，上層有大量(liáng)油(yóu)脂(zhī)應去(qù)除。取(qǔ)澄清的(dí)匀漿液(yè)進行(háng)下(xià)一步操作(zuò)。
5. 每使用1ml TRIzol加(jiā)入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘(zhōng)。樣(yàng)品分(fēn)為三層：底層為黃(huáng)色(sè)有機相(xiāng)，上層(céng)為(wéi)無色水(shuǐ)相和(hé)一個中間層。RNA主要(yào)在水相中，水相體積約(yuē)為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水(shuǐ)相轉(zhuǎn)移到新管(guǎn)中，如要(yào)分離DNA和蛋白(bái)質(zhì)可保留有機(jī)相，進一步(bù)操作見後(hòu)。用(yòng)異(yì)丙(bǐng)醇沉澱(diàn)水相中的RNA。每(měi)使(shǐ)用(yòng)1ml TRIzol加(jiā)入0.5ml異丙(bǐng)醇，室溫放置(zhì)10分(fēn)鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘(zhōng)，離(lí)心(xīn)前(qián)看不(bù)出RNA沉澱，離(lí)心後在(zài)管(guǎn)側和管(guǎn)底出(chū)現膠(jiāo)狀沉澱。移(yí)去上(shàng)清。
9. 用75℅乙醇洗滌(dí)RNA沉澱(diàn)。每使(shǐ)用(yòng)1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇(chún)。2-8℃不超(chāo)過7500×g離(lí)心5分鐘，棄(qì)上清(qīng)。
10.室溫放(fàng)置幹燥(zào)或真空抽幹RNA沉(chén)澱，大(dà)約(yuē)晾5-10分(fēn)鐘(zhōng)即可.不(bù)要(yào)真空離心(xīn)幹(gān)燥，過於(yú)幹燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性(xìng)大(dà)大(dà)降低(dī)。加入25-200μl無RNase的(dí)水(shuǐ)或0.5℅SDS,用槍頭吸(xī)打幾次(cì),55-60℃放置10分鐘使RNA溶(róng)解(jiě).如RNA用於酶切(qiē)反應(yīng),勿(wù)使(shǐ)用SDS溶液。RNA也可(kě)用100℅的去(qù)離子甲(jiǎ)酰胺(àn)溶解，-70℃保存(cún)。

注(zhù)意事項(xiàng)：
    1.從(cóng)少(shǎo)量樣品(pǐn)（1-10mg組織(zhī)或102-104細胞）中提取RNA時可加入少許(xǔ)糖原(yuán)以(yǐ)促進RNA沉澱。例如加800ml TRIzol匀漿樣品，沉(chén)澱(diàn)RNA前加(jiā)5-10μg RNase-free糖原。糖原(yuán)會(huì)與RNA一(yī)同(tóng)沉澱出(chū)來，糖(táng)原(yuán)濃度不高(gāo)於(yú)4mg/ml是(shì)不影響(xiǎng)*鏈的合成(chéng)，也不影(yǐng)響PCR反(fǎn)應。
   2．匀(yún)漿後(hòu)加氯(lǜ)仿(fǎng)之前(qián)樣(yàng)品可以在-60至-70℃保(bǎo)存至少(shǎo)一(yī)個月(yuè)。RNA沉澱可(kě)以(yǐ)保(bǎo)存(cún)於75% 酒精中2-8℃一(yī)星(xīng)期以(yǐ)上(shàng)或(huò)-5至(zhì)-20℃一(yī)年(nián)以上。
   3．分層和RNA沉澱時也可使用台(tái)式(shì)離心(xīn)機，2600×g離(lí)心30-60分(fēn)鐘。
預期產量(liáng)：1mg組(zǔ)織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為：
肝(gān)和脾(pí)6-10μg ,腎(shèn)3-4μg ,骨骼(gé)肌和腦組(zǔ)織(zhī)1-1.5μg ,胎盤(pán)1-4μg ,上皮細胞8-15μg ,成纖維細(xì)胞(bāo)5-7μg 。

常(cháng)見(jiàn)問(wèn)題(tí)分析(xī)：
1.得(dé)率低：

A.樣(yàng)品(pǐn)裂解或匀漿處(chǔ)理(lǐ)不*
B．RNA沉(chén)澱未(wèi)*溶(róng)解(jiě)
2.後A260/A280<1.65 ：

A.檢測(cè)吸光度(dù)時(shí)，RNA樣(yàng)品(pǐn)沒有(yǒu)溶於水，而(ér)溶(róng)於(yú)了TE中。低離(lí)子濃(nóng)度(dù)和(hé)低pH值條(tiáo)件(jiàn)下A280值(zhí)偏(piān)高
B．樣品匀漿(jiāng)時(shí)加的試(shì)劑量太少
C．匀漿(jiāng)樣品(pǐn)時(shí)未在(zài)室溫(wēn)放置5分(fēn)鐘
D．吸取水(shuǐ)相(xiāng)時(shí)混入了(liǎo)有(yǒu)機(jī)相(xiāng)
E．RNA沉(chén)澱未(wèi)*溶解。
3.RNA降(jiàng)解：

A.組織取出後(hòu)沒有(yǒu)馬(mǎ)上處(chǔ)理(lǐ)或(huò)冷凍
B.待提(tí)取(qǔ)RNA的樣品(pǐn)沒有(yǒu)保存(cún)於-60至-70℃,而保存(cún)在了-5至-20℃
C.細(xì)胞(bāo)在用胰(yí)酶(méi)處(chǔ)理時過度
D.溶液或離(lí)心管(guǎn)未(wèi)經(jīng)RNase去除(chú)處(chǔ)理
E.電泳時(shí)使用的甲(jiǎ)醛pH值(zhí)低於(yú)了(liǎo)3.5
4.DNA汙染:

A. 樣品匀漿時(shí)加的試劑(jì)量太(tài)少(shǎo)
B.樣品中(zhōng)含有有機(jī)溶劑（如乙醇(chún),DMSO等）,強緩衝(chōng)液或(huò)鹼(jiǎn)性溶液(yè)
5.蛋白聚糖和多糖汙染(rǎn):

沉澱(diàn)RNA的過(guò)程(chéng)中(zhōng)作(zuò)以(yǐ)下改進(jìn)可(kě)去除這(zhè)些(xiē)汙(wū)染(rǎn)，步驟7中,每(měi)使用(yòng)1ml TRIzol在水(shuǐ)相(xiāng)中加0.25ml異(yì)丙(bǐng)醇(chún)和0.25ml高(gāo)鹽溶液（0.8M檸檬(méng)酸(suān)鈉(nà)和1.2M NaCl）混(hùn)合離心,按之(zhī)前操作(zuò)進行。這種(zhǒng)方法可使蛋白聚糖(táng)和(hé)多(duō)糖(táng)留在(zài)溶液中，高(gāo)效沉澱出純RNA。從含有(yǒu)大量多(duō)糖(táng)的(dí)植(zhí)物(wù)中提取RNA時應在(zài)匀(yún)漿後離心(xīn)，並加上(shàng)以(yǐ)上(shàng)操作(zuò)步(bù)驟(zhòu)。