PCR實驗時汙染的(dí)預(yù)防方(fāng)法

　　PCR實驗時汙染的預防方法
　　進行PCR操作時
，操作(zuò)人員(yuán)應(yīng)該嚴格(gé)遵(zūn)守一些(xiē)操(cāo)作規(guī)程
，大(dà)程度(dù)地降(jiàng)低(dī)可能出現(xiàn)的PCR汙染或杜絕汙染的出現。
　　1.劃分操作區(qū)：目前
，普通PCR尚(shàng)不能做到單人單(dān)管
，實(shí)現*閉(bì)管操(cāo)作(zuò)
，但(dàn)無論是否(fǒu)能夠達到單(dān)人單管
，均要求(qiú)實(shí)驗操(cāo)作在三個不同(tóng)的(dí)區(qū)域內(nèi)進行
，PCR的前處(chǔ)理和後(hòu)處理要在不同的隔(gé)離區內(nèi)進(jìn)行：
　　(1)標本處(chǔ)理(lǐ)區
，包(bāo)括(kuò)擴(kuò)增摸(mō)板的製備(bèi)。
　　(2)擴(kuò)增區
，包括反應液的配製(zhì)和(hé)PCR擴(kuò)增。
　　(3)產(chǎn)物(wù)分(fēn)析(xī)區
，凝膠電泳分(fēn)析
，產(chǎn)物拍照及重組(zǔ)克隆(lóng)的製備(bèi)。
　　(4)各(gè)工作區(qū)要有一(yī)定的隔離
，操(cāo)作(zuò)器(qì)材專(zhuān)用(yòng)
，要(yào)有(yǒu)一定(dìng)的(dí)方向性(xìng)。如(rú)：標本製備→PCR擴增(zēng)→產物分析→產(chǎn)物(wù)處理(lǐ)。
　　切記：產(chǎn)物分(fēn)析(xī)區的產(chǎn)物及器材不(bù)要拿(ná)到其他兩(liǎng)個工作(zuò)區。
　　2.分裝(zhuāng)試(shì)劑(jì)：PCR擴(kuò)增(zēng)所(suǒ)需(xū)要的試劑(jì)均應(yīng)在(zài)裝有紫(zǐ)外燈的(dí)超淨工作台或(huò)負(fù)壓工(gōng)作台配(pèi)製和分裝。所有的加樣器(qì)和(hé)吸頭需固定(dìng)放(fàng)於其(qí)中(zhōng)
，不能(néng)用來吸(xī)取(qǔ)擴(kuò)增後的DNA和其(qí)他(tā)來源的(dí)DNA：
　　(1) PCR用(yòng)水(shuǐ)應為高壓(yā)的雙(shuāng)蒸水。
　　(2) 引(yǐn)物(wù)和dNTP用高壓(yā)的(dí)雙蒸水在無PCR擴增產物(wù)區(qū)配製。
　　(3)引(yǐn)物(wù)和dNTP應分裝(zhuāng)儲存(cún)
，分裝時應標明時間
，以(yǐ)備(bèi)發(fā)生(shēng)汙(wū)染時(shí)查找原因。
　　3. 實(shí)驗操(cāo)作(zuò)注意事項(xiàng)：盡管擴增(zēng)序列的殘(cán)留汙(wū)染(rǎn)大部(bù)分是(shì)假陽(yáng)性反應的(dí)原因(yīn)
，樣品(pǐn)間的交叉汙染(rǎn)也是(shì)原(yuán)因(yīn)之(zhī)一。因此
，不僅要(yào)在進(jìn)行擴(kuò)增(zēng)反應(yīng)是(shì)謹慎(shèn)認(rèn)真
，在(zài)樣(yàng)品的收(shōu)集，抽提和擴(kuò)增的(dí)所(suǒ)有環(huán)節(jié)都(dū)應(yīng)該(gāi)注(zhù)意(yì)：
　　(1)戴一次性手套
，若(ruò)不小(xiǎo)心濺上(shàng)反應(yīng)液
，立即更換手套。
　　(2)使用(yòng)一(yī)次性吸頭(tóu)
，嚴禁(jīn)與PCR產(chǎn)物分析(xī)室(shì)的吸(xī)頭(tóu)混用(yòng)
，吸(xī)頭不(bù)要長時(shí)間暴(bào)露(lòu)於空氣中(zhōng)
，避免(miǎn)氣(qì)溶膠的(dí)汙(wū)染。
　　(3)避(bì)免反應液飛(fēi)濺
，打開反應管(guǎn)時(shí)為(wéi)避免此(cǐ)種(zhǒng)情況(kuàng)
，開(kāi)蓋前(qián)稍(shāo)離(lí)心(xīn)收集(jí)液體於(yú)管(guǎn)底(dǐ)。若不(bù)小心濺(jiàn)到手套或桌麵(miàn)上(shàng)
，應立(lì)刻(kè)更(gēng)換手套並用稀(xī)酸(suān)擦拭桌麵(miàn)。
　　(4)操作多(duō)份(fèn)樣(yàng)品時(shí)
，製備反(fǎn)應混合液
，先(xiān)將(jiāng)dNTP，緩衝(chōng)液，引物和酶混(hùn)合(hé)好(hǎo)
，然後(hòu)分裝(zhuāng)
，這(zhè)樣即(jí)可以減(jiǎn)少操作
，避(bì)免汙(wū)染
，又(yòu)可以(yǐ)增加反應(yīng)的精(jīng)確(què)度。
　　(5)後(hòu)加入反應模(mó)板(bǎn)
，加入後(hòu)蓋(gài)緊反應管。
　　(6)操作(zuò)時(shí)設立(lì)陰陽性對照和空(kōng)白(bái)對照
，即(jí)可(kě)驗(yàn)證(zhèng)PCR反(fǎn)應(yīng)的可靠性(xìng)
，又可以協助判斷(duàn)擴增(zēng)係(xì)統的(dí)可信性(xìng)。
　　(7)盡可(kě)能用(yòng)可替換或可高壓(yā)處(chǔ)理的加樣器
，由於(yú)加樣(yàng)器(qì)容(róng)易受產物(wù)氣(qì)溶膠或標本DNA的汙(wū)染
，使(shǐ)用可(kě)替換或(huò)高壓(yā)處理(lǐ)的(dí)加樣器。如(rú)沒有這種(zhǒng)特殊的加樣(yàng)器
，至少PCR操(cāo)作(zuò)過程中加(jiā)樣器應(yīng)該(gāi)專用
，不能(néng)交叉使(shǐ)用
，尤(yóu)其是(shì)PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不(bù)能拿(ná)到(dào)其它兩個(gè)區(qū)。
　　(8)重復實驗
，驗證(zhèng)結(jié)果(guǒ)
，慎下結論。