亞克隆

已(yǐ)經獲得的目(mù)的(dí)DNA條(tiáo)帶進行(háng)重(zhòng)新(xīn)克隆(lóng)，其目的在(zài)於對目的(dí)DNA進(jìn)行(háng)進一(yī)步(bù)分析(xī)，或(huò)者(zhě)進行重(zhòng)組(zǔ)改造等。

亞(yà)克(kè)隆的基本過(guò)程包括(kuò)：

（1）目(mù)的DNA條(tiáo)帶和載體(tǐ)的製備
；（2）目的(dí)DNA條(tiáo)帶和(hé)載體(tǐ)的(dí)連接(jiē)
；（3）連接產(chǎn)物的(dí)轉(zhuǎn)化(huà)
；（4）重組子篩選。

目的DNA條(tiáo)帶(dài)和載體的(dí)製備(bèi)
    選(xuǎn)擇適宜(yí)的(dí)限製(zhì)性(xìng)核酸內(nèi)切酶，消(xiāo)化已(yǐ)知(zhī)目的DNA和(hé)載體(tǐ)，獲(huò)得綫(xiàn)性(xìng)DNA，用於(yú)重(zhòng)組。根(gēn)據(jù)目(mù)的(dí)DNA和(hé)載體的(dí)具(jù)體(tǐ)情況，選擇一種或者(zhě)兩(liǎng)種適當(dāng)的限(xiàn)製(zhì)酶(méi)切割(gē)，分別產(chǎn)生對(duì)稱(chēng)性(xìng)粘性末端(duān)（用一(yī)種限(xiàn)製(zhì)性(xìng)內切酶進行(háng)消(xiāo)化而(ér)產(chǎn)生(shēng)帶(dài)有互補(bǔ)突出(chū)端(duān)），不對稱粘性末(mò)端(duān)（用(yòng)兩種不(bù)同的限製性(xìng)內切(qiē)酶(méi)進(jìn)行(háng)消化而(ér)產(chǎn)生(shēng)帶有非互補突出端），平端。在(zài)亞克隆時(shí)，*不(bù)對稱相容(róng)末端(duān)連接，次(cì)選(xuǎn)對稱性(xìng)粘性相容(róng)性(xìng)末(mò)端連(lián)接(jiē)，由(yóu)於平末端連接(jiē)效率(shuài)較(jiào)低，通(tōng)常很少采(cǎi)用。但有(yǒu)時(shí)目(mù)的(dí)片段(duàn)的末(mò)端與(yǔ)載(zǎi)體不(bù)匹(pǐ)配 ，一(yī)般先將(jiāng)不匹配末端補平，然後(hòu)再以平末端(duān)連接(jiē)。

利(lì)用T4 DNA連接酶(méi)進行(háng)目的(dí)DNA條帶(dài)和(hé)載體的(dí)體外連(lián)接

連(lián)接(jiē)產(chǎn)物的(dí)轉化
⑴ 取100μl貯(zhù)存於-70℃鈣化(huà)菌，冰(bīng)浴(yù)化(huà)開
；
⑵ 加(jiā)入適量連接產物(wù)（一(yī)般(bān)不超過10μl，輕輕混(hùn)匀，冰浴20min
；
⑶ 於42℃熱休(xiū)克(kè)90s，迅速轉移(yí)至冰(bīng)浴中(zhōng)，繼續冰浴(yù)2-3min
；
⑷ 加入LB液體培養(yǎng)基200μl，於37℃緩搖孵育45min
；
⑸ 將培(péi)養(yǎng)物(wù)適(shì)量塗(tú)於1.5%瓊脂LB平(píng)板(bǎn)（根(gēn)據(jù)質(zhì)粒性質添加(jiā)抗生(shēng)素(sù)或(huò)/和X-Gal/IPTG），待膠表(biǎo)麵(miàn)沒有液(yè)體流(liú)動(dòng)時(shí)，37℃溫(wēn)箱倒(dǎo)置(zhì)培(péi)養12-16hr。

重組(zǔ)子(zǐ)的篩(shāi)選
   根據載(zǎi)體(tǐ)的(dí)遺傳特征(zhēng)篩(shāi)選重組(zǔ)子(zǐ)，如(rú)α-互補(bǔ)，抗生素基(jī)因(yīn)等(děng)。現(xiàn)在使用的許多載(zǎi)體都(dū)帶有一個大腸(cháng)杆(gān)菌的DNA的(dí)短(duǎn)區(qū)段，其(qí)中(zhōng)有(yǒu)β-半乳(rǔ)糖(táng)苷酶基因（lacZ）的調控序列(liè)和(hé)前(qián)146個(gè)氨基(jī)酸(suān)的編碼信(xìn)息。在這個(gè)編碼區(qū)中插(chā)入(rù)了一(yī)個多克(kè)隆位點（MCS），它(tā)並(bìng)不破壞(huài)讀(dú)框，但可(kě)使少數幾(jī)個(gè)氨(ān)基(jī)酸插(chā)入到β-半(bàn)乳糖苷酶(méi)的氨(ān)基端(duān)而不影響(xiǎng)功(gōng)能(néng)，這種載體(tǐ)適(shì)用於可編(biān)碼β-半乳(rǔ)糖苷(gān)酶(méi)C端(duān)部分序(xù)列的宿主細(xì)胞(bāo)。因(yīn)此(cǐ)，宿(sù)主(zhǔ)和質(zhì)粒編(biān)碼(mǎ)的(dí)片(piàn)段雖都沒有酶(méi)活(huó)性(xìng)，但它們同時(shí)存在(zài)時，可形成(chéng)具有(yǒu)酶學活(huó)性(xìng)的蛋(dàn)白質。這樣(yàng)，lacZ基(jī)因(yīn)在缺少近操縱基因(yīn)區(qū)段的(dí)宿主細胞與帶(dài)有完整(zhěng)近操縱(zòng)基因(yīn)區(qū)段的(dí)質粒之間實現(xiàn)了(liǎo)互補，稱(chēng)為α-互補。由(yóu)α-互(hù)補(bǔ)而產生(shēng)的(dí)LacZ 細(xì)菌在(zài)誘導劑(jì)IPTG的(dí)作用下(xià)，在(zài)生(shēng)色底(dǐ)物X-Gal存在時產(chǎn)生藍色(sè)菌(jūn)落，因(yīn)而(ér)易(yì)於(yú)識別(bié)。然(rán)而(ér)，當(dāng)外(wài)源DNA插入到質粒的(dí)多克(kè)隆(lóng)位點後，幾乎不(bù)可避(bì)免地(dì)導致無α-互(hù)補能力的氨(ān)基(jī)端(duān)片段，使得(dé)帶(dài)有(yǒu)重(zhòng)組(zǔ)質粒(lì)的細(xì)菌(jūn)形(xíng)成白色菌(jūn)落。這(zhè)種(zhǒng)重組子的篩(shāi)選(xuǎn)，又稱為藍(lán)白斑篩選(xuǎn)。如用(yòng)藍(lán)白斑(bān)篩(shāi)選(xuǎn)則經(jīng)連接產物(wù)轉化的(dí)鈣(gài)化菌平板(bǎn)37℃溫(wēn)箱倒置培養12-16hr後(hòu)，有重組(zǔ)質(zhì)粒的細菌(jūn)形成白色菌落(là)。