Western免(miǎn)疫印跡

    Western Blot采用的是(shì)聚丙(bǐng)烯酰(xiān)胺凝(níng)膠電泳，被(bèi)檢(jiǎn)測物是(shì)蛋(dàn)白(bái)質(zhì)，“探(tàn)針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的(dí)二抗。經(jīng)過PAGE分(fēn)離(lí)的蛋(dàn)白質樣品，轉(zhuǎn)移(yí)到(dào)固相(xiāng)載體(tǐ)（例如(rú)硝(xiāo)酸(suān)纖維素薄膜）上，固相載體以非(fēi)共(gòng)價鍵(jiàn)形式吸附蛋(dàn)白(bái)質，且(qiě)能(néng)保持(chí)電(diàn)泳(yǒng)分離(lí)的(dí)多肽(tài)類型及其生物學(xué)活性不變(biàn)。以固相載體上的(dí)蛋(dàn)白(bái)質或多(duō)肽作為抗(kàng)原，與對(duì)應(yīng)的抗體(tǐ)起免疫反應，再與酶或同(tóng)位素(sù)標記的第(dì)二抗體起(qǐ)反應(yīng)，經(jīng)過底(dǐ)物顯(xiǎn)色(sè)或放射自顯影(yǐng)以檢測電泳(yǒng)分離(lí)的特(tè)異(yì)性(xìng)目(mù)的基(jī)因表(biǎo)達(dá)的蛋白成(chéng)分(fēn)。該(gāi)技(jì)術(shù)也廣泛(fàn)應用於檢測(cè)蛋白水平(píng)的表達(dá)。

Western Blot操(cāo)作步(bù)驟
（一(yī)）蛋(dàn)白質(zhì)樣(yàng)品獲(huò)得：細菌誘導表(biǎo)達後，可(kě)通(tōng)過(guò)電(diàn)泳上樣緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)直接裂解(jiě)細(xì)胞，真核細(xì)胞加(jiā)匀漿緩衝(chōng)液，機(jī)械或超聲波室(shì)溫(wēn)匀(yún)漿0.5-1min。然後4℃，13,000g離(lí)心(xīn)15min。取上清液(yè)作(zuò)為(wéi)樣品。
（二(èr)）電泳(yǒng)：製備電泳凝(níng)膠(jiāo)，進行(háng)SDS-PAGE。
（三(sān)）轉移：（半幹式(shì)轉移(yí)）
1，電泳(yǒng)結束(shù)後將膠條(tiáo)割(gē)至(zhì)合(hé)適大小(xiǎo)，用轉(zhuǎn)膜緩衝(chōng)液平(píng)衡(héng)，5min×3次(cì)。
2，膜處(chǔ)理：預先裁好與膠(jiāo)條同樣(yàng)大(dà)小(xiǎo)的(dí)濾(lǜ)紙和NC膜(mó)，浸(jìn)入(rù)轉膜緩衝液(yè)中10min。
3，轉膜：轉膜(mó)裝(zhuāng)置(zhì)從下(xià)至上依(yī)次按(àn)陽(yáng)極碳板，24層(céng)濾紙，NC膜，凝膠，24層濾(lǜ)紙(zhǐ)，陰極碳(tàn)板的順序放(fàng)好(hǎo)，濾(lǜ)紙(zhǐ)，凝(níng)膠，NC膜精確(què)對(duì)齊，每一步(bù)去(qù)除氣泡(pào)，上壓500g重(zhòng)物，將(jiāng)碳板上多(duō)餘(yú)的液(yè)體(tǐ)吸幹。接(jiē)通(tōng)電源,恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移(yí)1.5hr。轉(zhuǎn)移(yí)結(jié)束(shù)後(hòu)，斷開電(diàn)源(yuán)將(jiāng)膜(mó)取(qǔ)出,割(gē)取待測(cè)膜條(tiáo)做免(miǎn)疫印跡。將有蛋白(bái)標準的條(tiáo)帶(dài)染色，放(fàng)入膜(mó)染(rǎn)色液中(zhōng)50s後(hòu)，在50%甲醇(chún)中多(duō)次脫色(sè)，至背景清(qīng)晰，然後(hòu)用雙(shuāng)蒸(zhēng)水洗(xǐ)，風(fēng)幹夾於兩(liǎng)層(céng)濾紙中保(bǎo)存，留與顯(xiǎn)色(sè)結果作(zuò)對比。
（四）免(miǎn)疫反(fǎn)應(yīng)：
1，用0.01M PBS洗膜(mó)，5min ×3次。
2，加(jiā)入(rù)包被(bèi)液，平穩搖(yáo)動(dòng)，室(shì)溫2hr。
3，棄包被(bèi)液，用(yòng)0.01M PBS洗膜，5min×3次。
4，加入一抗（按(àn)合適(shì)稀釋比例用(yòng)0.01M PBS稀釋，液體必須覆(fù)蓋膜的(dí)全(quán)部），4℃ 放(fàng)置12hr以上。陰性對照(zhào)，以1%BSA取代一抗(kàng)，其餘步(bù)驟與(yǔ)實驗組相(xiāng)同(tóng)。
5，棄(qì)一抗(kàng)和(hé)1%BSA，用0.01M PBS分(fēn)別(bié)洗膜，5min×4次。
6，加入辣根過(guò)氧(yǎng)化物(wù)酶(méi)偶聯(lián)的(dí)二抗（按合適稀釋比(bǐ)例用(yòng)0.01M  PBS稀釋），平穩搖(yáo)動(dòng)，室溫(wēn)2hr。
7，棄二(èr)抗(kàng)，用0.01M PBS洗膜(mó)，5min×4次。
8，加入(rù)顯(xiǎn)色液，避光顯(xiǎn)色(sè)至出現條帶時放(fàng)入雙蒸水中(zhōng)終(zhōng)止(zhǐ)反應。

Western Blot注意事(shì)項(xiàng)
1，一抗，二抗的稀釋度(dù)，作用時間和溫度(dù)對不同的蛋白(bái)要(yào)經過預實驗確定*條(tiáo)件。
2，顯色(sè)液必須新鮮(xiān)配置(zhì)使用，zui後(hòu)加入H2O2。
3，DAB有(yǒu)致癌(ái)的潛(qián)在可能(néng)，操(cāo)作時要小心仔細。