淺(qiǎn)談(tán)基因的亞克(kè)隆

    ：細胞克隆(lóng)中，對培養的細(xì)胞來說(shuō)，從(cóng)原有的克隆中，再篩選出具有某種特性(xìng)的細胞(bāo)進行培養(yǎng)，就(jiù)是(shì)subclone，分為(wéi)細胞克(kè)隆和(hé)分子克隆。

一，

1，掌握(wò)細菌基因組(zǔ)提取(qǔ)的(dí)方(fāng)法和(hé)原(yuán)理。

2，掌(zhǎng)握限(xiàn)製(zhì)性核(hé)酸(suān)內切(qiē)酶處理(lǐ)基因組(zǔ)及其(qí)結(jié)果分(fēn)析。

3，掌(zhǎng)握基因(yīn)片段回收(shōu)的方(fāng)法(fǎ)。

 

二(èr)，

    細(xì)菌基因組的(dí)提(tí)取：通(tōng)過(guò)鹼(jiǎn)法或(huò)者酶法裂(liè)解細(xì)菌(jūn)之(zhī)後(hòu)，可(kě)以將胞內的(dí)核(hé)酸和蛋(dàn)白(bái)質全釋(shì)放(fàng)出來(lái)。DNA溶(róng)於(yú)1mol/L的NaCl中，不(bù)溶於(yú)0.14mol/L的NaCl，而RNA溶於(yú)0.14mol/L的NaCl不(bù)溶(róng)於(yú)1mol/L的NaCl中(zhōng)，通過溶(róng)液中(zhōng)鹽濃度(dù)的變(biàn)化可以(yǐ)將(jiāng)DNA和RNA分(fēn)開(kāi)。氯仿(fǎng)－異(yì)戊(wù)醇(chún)法除(chú)去蛋白(bái)，2倍體積乙(yǐ)醇將DNA沉(chén)澱出來。

    限製(zhì)性核(hé)酸內切酶(méi)隻作(zuò)用(yòng)於(yú)特(tè)定(dìng)的(dí)位(wèi)點(diǎn)，處理基因組後隻會(huì)得到有(yǒu)限(xiàn)的(dí)片斷。通過單酶切或者多酶切後電泳檢驗就(jiù)可以(yǐ)得(dé)到與物(wù)種本身(shēn)有關的(dí)特(tè)定(dìng)的圖譜(pǔ)。

    電泳後選定目(mù)的(dí)基因的條(tiáo)帶，紫外燈(dēng)下(xià)將含(hán)有目(mù)的基因的凝(níng)膠(jiāo)切下，使(shǐ)用凝(níng)膠(jiāo)回收試(shì)劑盒，將(jiāng)凝(níng)膠(jiāo)溶化後(hòu)，通(tōng)過吸(xī)附柱時，核酸片(piàn)段(duàn)就吸附(fù)在(zài)柱上，洗脫(tuō)液洗(xǐ)脫後加入(rù)2倍體(tǐ)積乙醇，核酸沉澱(diàn)，TE溶(róng)解(jiě)沉(chén)澱(diàn)，核(hé)酸(suān)片(piàn)段(duàn)得(dé)到回收。

 

三，試劑與器(qì)材

1，試劑(jì) E.coli JM109，牛肉膏，胰蛋白腖，NaCl，微(wēi)量細(xì)菌基(jī)因組抽(chōu)提試劑(jì)盒（上海(hǎi)生工(gōng)），BamH I，Xho1 核(hé)酸內(nèi)切酶（Takara），NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子(zǐ)量片(piàn)段(duàn)（1kb DNA Ladder），凝膠電泳(yǒng)回收試(shì)劑(jì)盒

2，器材(cái) 高速台式冷(lěng)凍(dòng)離(lí)心機，水平電泳(yǒng)儀(yí)，漩渦(wō)混合儀(yí)，紫外(wài)檢測(cè)儀(yí)，凝膠(jiāo)成(chéng)像分析係統，微量移液器(qì)及(jí)吸頭(tóu)。

 

四(sì)，操作方法

1．使用(yòng)LB培養(yǎng)基活化，培(péi)養(yǎng)菌體。

2．離(lí)心收集菌體(tǐ)，根(gēn)據(jù)試劑盒(hé)說明提取(qǔ)基因組。

3．限製性酶處理基(jī)因組(zǔ)。

4．E.coli JM109的基(jī)因組經(jīng)過限製性內切酶處(chǔ)理後，使用(yòng)瓊(qióng)脂糖凝膠(jiāo)電泳檢測(cè)，凝膠(jiāo)成(chéng)像係統將酶(méi)切圖譜采集下(xià)來並對(duì)其分析。

5．紫(zǐ)外燈下將需要(yào)回收的(dí)核酸片(piàn)段(duàn)切下來(lái)，使用(yòng)凝(níng)膠(jiāo)回(huí)收試劑盒回收DNA片段。

6．電(diàn)泳檢(jiǎn)測回(huí)收的(dí)核(hé)酸(suān)片段。

 

五(wǔ)，關鍵(jiàn)步(bù)驟(zhòu)與注意事項

1．菌(jūn)體(tǐ)培(péi)養過(guò)程要(yào)嚴(yán)格(gé)無菌(jūn)，染菌(jūn)後(hòu)提(tí)取(qǔ)得到(dào)的基因組會(huì)成多條帶，酶切(qiē)的圖(tú)譜(pǔ)也會(huì)比(bǐ)較復雜(zá)。

2．基因(yīn)組提(tí)取過(guò)程中所(suǒ)使用的器材要嚴格(gé)滅菌，防止(zhǐ)核(hé)酸酶(méi)降解(jiě)基(jī)因組。

3．基因組提取過程不可以(yǐ)劇烈(liè)振(zhèn)蕩(dàng)，防止(zhǐ)DNA斷鏈(liàn)。

4．在內切酶zui適條(tiáo)件(jiàn)下充(chōng)分處(chǔ)理基(jī)因組(zǔ)，得(dé)到正確的圖(tú)譜(pǔ)。

5．瓊脂糖溶化要充分(fēn)。

6．切下凝膠時(shí)要注意防護紫外(wài)綫(xiàn)，電泳(yǒng)結束之後(hòu)盡(jìn)快將膠條切下來(lái)，凝膠條要窄，脫尾部分(fēn)不回(huí)收。