實時熒光定(dìng)量(liáng)PCR技(jì)術(shù)（Real Time Quantitative PCR）

在PCR反(fǎn)應體(tǐ)係(xì)中加入熒光基(jī)團(tuán)，利(lì)用熒(yíng)光信號(hào)積累實(shí)時監測(cè)整(zhěng)個(gè)PCR進(jìn)程，zui後通(tōng)過標準(zhǔn)曲(qū)綫(xiàn)對未(wèi)知(zhī)模(mó)板進(jìn)行定量分析(xī)的方法。

相(xiāng)對定(dìng)量(liáng)應(yīng)用(yòng)（Relative Quantification，RQ）    

 特(tè)異性熒光標記：

 TaqMan法

 TaqMan探針的(dí)特性：

（1）5′端標(biāo)記(jì)有報告(gào)基(jī)團（Reporter, R），如FAM，VIC等

（2）3′端(duān)標記有熒(yíng)光(guāng)淬(cuì)滅(miè)基(jī)團 （Quencher, Q）

（3）探(tàn)針(zhēn)完整(zhěng)，R所發射(shè)的熒(yíng)光(guāng)能量被(bèi)Q基(jī)團吸(xī)收 ，無熒(yíng)光(guāng)， R與Q分(fēn)開，發熒(yíng)光

（4）Taq酶(méi)有(yǒu) 5′→3′外(wài)切核(hé)酸酶(méi)活性，可水(shuǐ)解(jiě)探針

相(xiāng)對定量通過內標定(dìng)量(liáng)：
內(nèi)標(biāo)（Endogenous Control）通(tōng)常(cháng)是(shì)β-actin，GAPDH基因(yīn)等(děng)看(kàn)家基因，在細胞中的(dí)表達(dá)量或(huò)在基因(yīn)組中(zhōng)的(dí)拷貝數(shù)恒(héng)定(dìng)，受(shòu)環(huán)境因(yīn)素影響小，內(nèi)標定(dìng)量(liáng)結(jié)果代表(biǎo)了樣(yàng)本中(zhōng)所(suǒ)含細胞或基因(yīn)組數量。

相(xiāng)對(duì)定量分析方(fāng)法(fǎ)  ：

 2-ΔΔCt
前提：目(mù)標序列和內參序(xù)列的擴(kuò)增效率(shuài)接近100％且偏(piān)差(chà)在5％以內
  1，用內(nèi)參(cān)基(jī)因的CT值歸一目標基因的CT值(zhí)：
    ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test） 
    ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator） 
  2，用(yòng)校準(zhǔn)樣本(běn)的ΔCT值(zhí)歸(guī)一(yī)試(shì)驗(yàn)樣(yàng)本的ΔCT值(zhí)：
         ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
  3，計算(suàn)表(biǎo)達水平比(bǐ)率(shuài)：
                    2 –ΔΔCT=表達量的(dí)比值

服務流程：

注意(yì)：客戶可根(gēn)據所(suǒ)能提供的起(qǐ)始材(cái)料(liào)不同，選(xuǎn)擇(zé)從(cóng)步(bù)驟1或2啟動項目(mù)。