siRNA幹(gān)擾檢(jiǎn)測

原(yuán)理(lǐ)：RNA幹擾 (RNA interference, RNAi)技術，是將(jiāng)與內源(yuán)mRNA 編碼區同源的小(xiǎo)片段(duàn)(19 -23bp)外源(yuán)雙(shuāng)鏈(liàn) RNA(siRNA)導入(rù)細胞(bāo)中，引發細胞中相(xiāng)應mRNA 高(gāo)效(xiào)特異性(xìng)降解，從(cóng)而(ér)導致特定基因表達(dá)沉默(mò)(knock down)的一種實驗技(jì)術，其(qí)中通(tōng)過(guò)構建表達(dá)載體(tǐ)表(biǎo)達siRNA是多種siRNA製備方(fāng)法中有可(kě)能(néng)進(jìn)行(háng)長期(qī)基因沉(chén)默(mò)研(yán)究(jiū)的方法(fǎ)，siRNA 載體可以在細胞內直(zhí)接(jiē)轉(zhuǎn)錄出shrna ，其(qí)幹擾效果等同於(yú)siRNA ，而(ér)且(qiě)能夠解(jiě)決 siRNA幹擾(rǎo)時(shí)間(jiān)短(duǎn)的(dí)缺點。您(nín)隻需提(tí)供需幹擾(rǎo)基因的詳細信息，包(bāo)括(kuò)基(jī)因(yīn)的(dí) mRNA 序(xù)列，Genbank Accession No. 和(hé)所屬物種，本公(gōng)司負責(zé)設計3條(tiáo)針對(duì)目的(dí)mRNA的(dí)siRNA 靶(bǎ)序(xù)列，在(zài)短時間內(nèi)構建三(sān)個(gè)可(kě)用(yòng)於(yú)目的(dí)mRNA幹擾(rǎo)實驗(yàn)的siRNA 載體(tǐ)並為您(nín)進行後(hòu)續的幹擾實(shí)驗研(yán)究。

siRNA幹擾檢測實驗流(liú)程(chéng)

◇ 選擇siRNA表達載體 通過人(rén)工(gōng)合成基因的方法(fǎ)將該序列克(kè)隆至(zhì)Clontech公司的RNAi-Ready pSIREN係列表達載體(tǐ)中，該係(xì)列(liè)表達載體帶有Pol III(U6)啟動子，具有轉染(rǎn)效率高，操(cāo)作簡(jiǎn)單，rna沉(chén)默效(xiào)果易於檢測(cè)等特(tè)點，客戶(hù)可根(gēn)據(jù)需要進(jìn)行選擇。

◇ 設(shè)計siRNA靶序列(liè)

◇ 根據客戶(hù)提(tí)交的目(mù)的(dí)mRNA序列(liè)，設(shè)計3條RNA幹擾靶序列(liè)，靶序(xù)列一般(bān)為19-21nt 長。

◇ 對於(yú)每(měi)條(tiáo)選定的siRNA 靶序列，設(shè)計(jì) siRNA 正義鏈(liàn)和反義鏈，以(yǐ) loop(9nt or 10nt) 相(xiāng)連，形成穩定(dìng)的發(fā)卡RNA，稱為 shRNA(short hairpin RNA)。

◇ 合成(chéng)模板(bǎn) 合成(chéng)每(měi)條編(biān)碼 shRNA的DNA 模(mó)板，並連接到(dào) siRNA 載體相應(yīng)的(dí)多克(kè)隆位點之(zhī)間(jiān)。連(lián)接(jiē)產物轉化DH5α大腸杆(gān)菌。

◇ 抽提(tí)陽(yáng)性(xìng)克(kè)隆(lóng)質(zhì)粒 公司(sī)試(shì)劑盒抽提(tí)陽(yáng)性(xìng)克(kè)隆(lóng)載(zǎi)體(tǐ)並定(dìng)量。

◇ 轉染細胞(bāo) 質粒直接轉染(rǎn)或通過(guò)病(bìng)毒(dú)包(bāo)裝後轉染(rǎn)細胞，並(bìng)對轉(zhuǎn)染細胞進行陽性(xìng)鑒(jiàn)定(dìng)和轉代細(xì)胞株的(dí)培養。

◇ 幹(gān)擾效(xiào)果(guǒ)檢測(cè)

◇ 基因水平上檢(jiǎn)測(cè) 提取RNA，反轉(zhuǎn)錄(lù)，Realtime PCR檢(jiǎn)測(cè)幹擾效果(客(kè)戶自備細胞係)。

◇ 蛋白(bái)水(shuǐ)平(píng)上檢測 Western Blot檢(jiǎn)測(cè)蛋白水平幹擾(rǎo)效(xiào)果(guǒ)(客戶自備一抗)。

服(fú)務周期(qī)及價(jià)格(gé)

服(fú)務(wù)說(shuō)明(míng)

◇ siRNA服(fú)務(wù)需客戶(hù)與(yǔ)我們(mén)共同(tóng)討(tǎo)論(lùn)實(shí)驗方(fāng)案(àn)，並(bìng)提(tí)供靶(bǎ)基因(yīn)名稱，序(xù)列(liè)或(huò)GeneBank ID和希(xī)望插入載體(tǐ)的名(míng)稱等，免費為您設計siRNA序列(liè)。

◇ 由於構(gòu)建(jiàn)的siRNA表達載(zǎi)體(tǐ)中插(chā)入的片段(duàn)可(kě)以(yǐ)形(xíng)成(chéng)hairpin結構，因此可能會影響測序。如(rú)果(guǒ)我(wǒ)們(mén)對質粒(lì)測序(xù)結(jié)果不理想時(shí)，將(jiāng)對由質(zhì)粒(lì)擴增得到的PCR產(chǎn)物進行(háng)測序(xù)。