RNAi幹擾檢測(cè)廠(chǎng)家是指(zhǐ)在(zài)進(jìn)化過程(chéng)中高度保守的，由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的，同(tóng)源(yuán)mRNA高(gāo)效特異性降解的現象。基因沉(chén)默，主要(yào)有(yǒu)轉(zhuǎn)錄(lù)前水平(píng)的基(jī)因沉(chén)默(TGS)和轉(zhuǎn)錄後(hòu)水(shuǐ)平(píng)的(dí)基(jī)因(yīn)沉(chén)默(PTGS)兩類:TGS是指由(yóu)於DNA修飾(shì)或染色體異染色質化(huà)等(děng)原(yuán)因(yīn)使(shǐ)基(jī)因不(bù)能(néng)正常轉錄(lù);PTGS是(shì)啟動(dòng)了(liǎo)細胞質(zhì)內靶(bǎ)mRNA序(xù)列(liè)特(tè)異性(xìng)的(dí)降解機製。有時(shí)轉基因會同時(shí)導(dǎo)致TGS和(hé)PTGS。

RNAi幹(gān)擾(rǎo)檢測廠(chǎng)家 主體實驗(yàn)：

　　一(yī)，成功將siRNA表(biǎo)達(dá)載體導(dǎo)入目(mù)的細(xì)胞

　　如(rú)果目的細胞(bāo)的(dí)質(zhì)粒轉染(rǎn)效(xiào)率(shuài)較低(dī)（低於70%），則應采(cǎi)用腺病(bìng)毒(dú)或(huò)慢(màn)病毒(dú)載(zǎi)體(tǐ)，利用(yòng)病毒(dú)載體的高感(gǎn)染率，高(gāo)表達特性，更(gēng)好地(dì)開(kāi)展RNA幹擾主體(tǐ)實(shí)驗。

二，設置好分(fēn)組和(hé)對照

　　按(àn)照(zhào)nature的標(biāo)準(zhǔn)，一個嚴(yán)格(gé)的RNAi介導knockdown實(shí)驗要有(yǒu)6個對(duì)照：

　　⒈轉(zhuǎn)染(rǎn)試劑對(duì)照(zhào)（監(jiān)控轉(zhuǎn)染及培養條件(jiàn)對(duì)結(jié)果的(dí)影(yǐng)響）；

　　⒉nonsense siRNA對(duì)照（監控(kòng)外(wài)源核酸本(běn)身(shēn)對結(jié)果(guǒ)的(dí)影響）；

　　⒊positive siRNA對照(zhào)（監控(kòng)假(jiǎ)陰(yīn)性）；

　　⒋技術(shù)重(zhòng)復對照（也叫off-target 對照(zhào)，也(yě)就是(shì)利(lì)用至(zhì)少(shǎo)2個(gè)靶點(diǎn)的(dí)siRNA同時實(shí)驗，2個(gè)siRNA互為(wéi)off-target control，當兩(liǎng)者的表(biǎo)型(xíng)相同(tóng)時(shí)，才有可能(néng)是特(tè)異性的(dí)knockdown效(xiào)應）；

　　⒌rescue 對照(zhào)（knockdown之後做(zuò)超(chāo)表(biǎo)達，看是(shì)否有性狀(zhuàng)的逆轉(zhuǎn)，這也是(shì)為(wéi)了說明knockdown的特(tè)異性）；6.全表(biǎo)達組(zǔ)掃描對(duì)照(zhào)（就是轉(zhuǎn)錄(lù)/表達(dá)芯(xīn)片(piàn)掃(sǎo)描(miáo)，以zui終確(què)定表(biǎo)型不(bù)是由於(yú)off-target造成）。

　　實(shí)際實驗(yàn)中，全(quán)表達組(zǔ)掃(sǎo)描(miáo)對照(zhào)很(hěn)少有(yǒu)文(wén)獻涉及。其它幾個對照(zhào)中，1,2兩種對(duì)照即(jí)所(suǒ)謂的空(kōng)白(bái)細(xì)胞(bāo)對照，NC對(duì)照，基本(běn)是(shì)所有雜(zá)誌都(dū)要(yào)求具(jù)備(bèi)的(dí)。4,5兩(liǎng)種對(duì)照(zhào)，主要是(shì)為(wéi)了解決off-target效應(yīng)，選做(zuò)一(yī)種即可，一(yī)般建(jiàn)議(yì)選5，涉及(jí)的實驗即所謂的“RNA幹(gān)擾(rǎo)回復實驗(yàn)”，

　　三(sān)，（體(tǐ)外）

　　一般(bān)應該(gāi)從(cóng)mRNA水平(píng)，蛋(dàn)白(bái)質(zhì)水(shuǐ)平，細胞(bāo)表型水(shuǐ)平三個(gè)層次(cì)來(lái)檢(jiǎn)測幹(gān)擾效率(shuài)。

　　mRNA水(shuǐ)平(píng)：RT-PCR，Real-time PCR；蛋白質水平：Western-blot，ELISA，免疫組化(huà)；細胞表型水平：MTT，克隆形(xíng)成實驗(yàn)，流(liú)式細胞(bāo)檢(jiǎn)測(cè)，細(xì)胞(bāo)小室實驗等。RNA幹擾(rǎo)效率在動物模型(xíng)上的進(jìn)一步(bù)驗(yàn)證（體內）　動物(wù)模(mó)型實驗可以(yǐ)采(cǎi)取“體內法(fǎ)”和“體外法(fǎ)”。

　　體內(nèi)法，即(jí)先(xiān)做裸鼠成瘤(liú)模(mó)型，再將質(zhì)粒或病毒導入裸(luǒ)鼠，檢(jiǎn)測RNA幹擾(rǎo)效(xiào)果(guǒ)。此法(fǎ)操作(zuò)復雜，對質(zhì)粒和(hé)病(bìng)毒產品的(dí)質和(hé)量要求都較(jiào)高(gāo)，但(dàn)是比較貼近(jìn)實際，說服(fú)力較(jiào)顯(xiǎn)著(zhù)。體外法，即先(xiān)將(jiāng)質粒(lì)或病毒導入腫瘤(liú)細胞(bāo)，再將腫瘤細胞導入動(dòng)物(wù)體(tǐ)內(nèi)，然(rán)後(hòu)檢測(cè)RNA幹擾效(xiào)果。此法(fǎ)操(cāo)作較(jiào)簡單，對質粒和病毒(dú)產(chǎn)品的質量要求(qiú)較(jiào)低(dī)，所以為大(dà)多數文(wén)獻所采(cǎi)用。建議采用此方(fāng)法(fǎ)來進行(háng)動物模(mó)型(xíng)水平(píng)的(dí)實(shí)驗。