RNAi幹(gān)擾檢測核心要(yào)點概要

 　　RNAi幹擾(rǎo)檢(jiǎn)測(cè)是一(yī)個十(shí)分(fēn)重要(yào)的環節(jié)。不(bù)管是設備(bèi)還(huán)是環(huán)境都是(shì)要的合格(gé)，在(zài)進行(háng)幹擾檢測(cè)之(zhī)前(qián)應該(gāi)考(kǎo)慮靶基因(yīn)產(chǎn)物(wù)的半衰(shuāi)期及其在細胞中(zhōng)的(dí)豐度和表(biǎo)達調(tiáo)控(kòng)機製(zhì)。由於(yú)RNAi幹擾檢測(cè)是通過降解靶基因(yīn)RNA而達到(dào)一(yī)直基因表(biǎo)達的目的，因此它(tā)不使(shǐ)用於(yú)研(yán)究那些(xiē)具(jù)有長半(bàn)衰(shuāi)期(qī)的蛋白質在(zài)細(xì)胞中的功能，RNAi幹(gān)擾(rǎo)檢測不(bù)能像基因敲(qiāo)除（gene knockout）一樣(yàng)在特定的(dí)細胞(bāo)中確(què)實靶(bǎ)基因(yīn)，它隻能較大限(xiàn)度的(dí)抑製(zhì)靶基因的(dí)表(biǎo)達，其(qí)抑製(zhì)效(xiào)率zui高可達95％以(yǐ)上，因(yīn)此這種方(fāng)法又(yòu)被稱為基(jī)因(yīn)敲(qiāo)減（gene knockdown）。據(jù)此(cǐ)，RNAi幹擾檢測不適(shì)用(yòng)於有些(xiē)酶(méi)基因功(gōng)能(néng)的研究(jiū)，因為(wéi)有時(shí)候微量(liáng)的(dí)酶分(fēn)子就(jiù)可(kě)以在細(xì)胞中(zhōng)行使功能，酶基因(yīn)表達的抑(yì)製並(bìng)不能從表(biǎo)型上(shàng)檢(jiǎn)測(cè)到明顯(xiǎn)的變化。
 
　　為了使RNAi幹擾檢(jiǎn)測達(dá)到(dào)理(lǐ)想(xiǎng)效(xiào)果(guǒ)，我們必須注(zhù)意(yì)以(yǐ)下事項：
 
　　不同細胞(bāo)的(dí)轉染(rǎn)效率(shuài)不(bù)同(tóng)，一(yī)次(cì)對於(yú)不(bù)同(tóng)的(dí)轉(zhuǎn)染試(shì)劑和培養細胞需要(yào)通過(guò)預試驗來確(què)定轉(zhuǎn)染的條(tiáo)件(jiàn)，對(duì)一種細(xì)胞行之有(yǒu)效(xiào)的方法(fǎ)並(bìng)不(bù)一(yī)定適用(yòng)於(yú)另一(yī)種細胞。正(zhèng)常情況(kuàng)下(xià)生長狀況(kuàng)良(liáng)好的(dí)細胞(bāo)轉染效率比(bǐ)生(shēng)長狀(zhuàng)況較差的細(xì)胞要高。RNAi幹擾檢(jiǎn)測(cè)盡量(liáng)采用(yòng)傳代次數較少(shǎo)的細胞，因為轉染效(xiào)率隨著(zhuó)傳代次數的增加(jiā)而逐漸(jiàn)下降，一般(bān)采用(yòng)傳(chuán)代(dài)次(cì)數在(zài)50代以內(nèi)的細胞(bāo)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(rǎn)。對細胞的轉染(rǎn)效率影響比(bǐ)較(jiào)大(dà)的另(lìng)一(yī)種(zhǒng)因素(sù)是細胞的生(shēng)長密度，RNAi幹(gān)擾(rǎo)檢(jiǎn)測對(duì)貼壁的(dí)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，*轉(zhuǎn)染密度為30％～70％，太低或(huò)太(tài)高都會導致轉(zhuǎn)染效(xiào)率(shuài)的(dí)下(xià)降。
 
　　如(rú)果一個siRNA分(fēn)子在(zài)細胞(bāo)中(zhōng)不(bù)能(néng)抑(yì)製靶基因(yīn)的(dí)表達，首先應該查明RNAi幹(gān)擾檢測所采(cǎi)用的(dí)基因(yīn)序列和(hé)試(shì)驗(yàn)用(yòng)的(dí)細胞係是(shì)否(fǒu)來(lái)源於同一物(wù)種，然後(hòu)檢(jiǎn)查所采(cǎi)用的基因(yīn)序(xù)列(liè)是否(fǒu)是(shì)可靠的，因(yīn)為它(tā)可(kě)能(néng)存在序(xù)列錯(cuò)誤，突變（在腫(zhǒng)瘤細胞(bāo)中(zhōng)）或核(hé)苷酸多態(tài)性。
 
　　RNAi幹(gān)擾檢測抑(yì)製靶(bǎ)基因的(dí)表達(dá)以後(hòu)，先(xiān)觀察(chá)細胞(bāo)表型的變化，如(rú)細(xì)胞(bāo)生(shēng)長狀況與(yǔ)形狀(zhuàng)的變化(huà)。然後通過免疫(yì)印(yìn)記(jì)與免疫(yì)熒光(guāng)檢測(cè)細胞(bāo)內蛋(dàn)白質(zhì)水(shuǐ)平的(dí)變化(huà)。如果沒有特(tè)異(yì)性(xìng)的(dí)靶(bǎ)蛋(dàn)白(bái)抗體，RNAi幹擾(rǎo)檢(jiǎn)測(cè)可以(yǐ)通(tōng)過Northern印記(jì)確定(dìng)其(qí)mRNA變化。
 
　　必須采取措(cuò)施防(fáng)止並消除可(kě)能的Rnase汙(wū)染。因為極少量的Rnase就可(kě)以破壞(huài)整個RNAi幹擾(rǎo)檢(jiǎn)測試(shì)驗，而(ér)RNAase遍布整個實(shí)驗室(shì)，用(yòng)適當的(dí)陽性siRNA對(duì)照優(yōu)化轉(zhuǎn)染(rǎn)和檢測條(tiáo)件。對(duì)於(yú)大(dà)多(duō)數(shù)細胞來(lái)說看(kàn)家(jiā)基因是zui合適的(dí)陽性對照，用(yòng)不(bù)同濃度(dù)的看家基(jī)因siRNA轉染(rǎn)細胞(bāo)，RNAi幹(gān)擾檢測48小時(shí)後(hòu)檢(jiǎn)測看(kàn)家(jiā)基因(yīn)蛋白(bái)質或mRNA水平(píng)，以(yǐ)確定靶siRNA轉(zhuǎn)染的*條(tiáo)件，試(shì)驗中應(yīng)包(bāo)含1～2個陰性對(duì)照(zhào)以確定(dìng)siRNA分子(zǐ)對靶基因(yīn)的(dí)抑(yì)製作用的特異性。
 
　　RNAi幹(gān)擾檢(jiǎn)測(cè)用於(yú)轉(zhuǎn)染的(dí)siRNA分(fēn)子的濃(nóng)度(dù)同靶基因的特性(xìng)和(hé)細胞(bāo)類型(xíng)相(xiāng)關(guān)。濃度太(tài)高(gāo)會導致細(xì)胞毒性(xìng)，濃度太(tài)低(dī)則不(bù)易檢(jiǎn)測到(dào)靶基(jī)因(yīn)表(biǎo)達水(shuǐ)平(píng)的(dí)變(biàn)化一次用於轉染細胞(bāo)的(dí)siRNA分(fēn)子濃度一(yī)般(bān)在30～100nmol/L之間，體(tǐ)外合成的(dí)siRNA分子(zǐ)對(duì)靶基因(yīn)的(dí)抑(yì)製作用是瞬時(shí)的，RNAi幹(gān)擾(rǎo)檢(jiǎn)測細(xì)胞中(zhōng)受(shòu)到抑(yì)製的(dí)靶蛋(dàn)白一(yī)般在(zài)轉(zhuǎn)染(rǎn)5～7天之後，即經(jīng)過(guò)7～10個(gè)細胞增(zēng)殖(zhí)周(zhōu)期之(zhī)後就可以(yǐ)逐漸恢復至正(zhèng)常(cháng)水平。
 
　　上海(hǎi)基屹(yì)生(shēng)物(wù)科技(jì)有限公司(sī)在(zài)操作(zuò)RNAi幹(gān)擾(rǎo)檢(jiǎn)測(cè)這(zhè)一方(fāng)麵有(yǒu)很好(hǎo)的經驗，歡迎(yíng)廣大(dà)新老客(kè)戶，歡(huān)迎(yíng)洽談！