TA克(kè)隆對(duì)基因技(jì)術(shù)的新進(jìn)展(zhǎn)

 　　TA克隆是一種(zhǒng)以表達(dá)為(wéi)基礎(chǔ)的(dí)基因分(fēn)離技(jì)術。它直接用(yòng)基因組DNA如(rú)酵(jiào)母人(rén)工(gōng)染色(sè)體(YACs)捕捉克(kè)隆(lóng)片段，從(cóng)而(ér)達(dá)到快速(sù)地(dì)從大(dà)的基(jī)因組(zǔ)區(qū)域(yù)分離表達(dá)序列。其主(zhǔ)要技術是(shì)用(yòng)PCR擴增(zēng)來自不同組織(zhī)的混合(hé)TA克隆(lóng)池或(huò)已克隆的(dí)克隆文(wén)庫，擴(kuò)增的(dí)克隆(lóng)片段與用(yòng)生(shēng)物素隨機標(biāo)記的基(jī)因(yīn)組目標(biāo)DNA雜交(jiāo)，捕獲親和(hé)素標記(jì)磁珠(zhū)上(shàng)的與(yǔ)目標DNA雜(zá)交(jiāo)的(dí)克隆(lóng)片(piàn)段，然後洗脫磁缽上(shàng)捕獲(huò)的(dí)TA克(kè)隆(lóng)並進行(háng)PCR擴增，再(zài)進行第二(èr)輪篩(shāi)選(xuǎn)，並(bìng)將篩選出的(dí)克隆片(piàn)段克(kè)隆到載(zǎi)體上(shàng)。
 
　　TA克隆(lóng)產物克隆(lóng)方法(fǎ)的(dí)新(xīn)進展,隨著(zhuó)克(kè)隆(lóng)技術(shù)的(dí)發展(zhǎn)和普及，克(kè)隆(lóng)克(kè)隆(lóng)產(chǎn)物已經廣泛(fàn)的(dí)應用(yòng)於分子生(shēng)物學的各(gè)個領域(yù)。通(tōng)常(cháng)克(kè)隆(lóng)產(chǎn)物不(bù)具(jù)有(yǒu)粘(nián)端(duān)，隻能(néng)進行(háng)平(píng)端連接(jiē)的(dí)克隆，且由於ＴａｑＤＮＡ聚合酶(méi)具(jù)有非模板(bǎn)依賴(lài)性(xìng)末端轉移酶活性(xìng)，能在兩(liǎng)條(tiáo)ＤＮＡ鏈(liàn)的３'末(mò)端(duān)加上一個多餘(yú)的(dí)鹼基，致使平(píng)端(duān)連接的(dí)效率不(bù)高(gāo)，克隆效率(shuài)低(dī)。改(gǎi)進的方法一(yī)股(gǔ)是在TA克隆引物的(dí)５'端(duān)加上(shàng)限製性(xìng)內切酶識別(bié)序列(liè)，或是(shì)改(gǎi)變(biàn)引物(wù)中(zhōng)ｌ至數(shù)個核昔(xī)酸引入限製酶位(wèi)點，然(rán)後(hòu)用相應的酶(méi)處理克隆(lóng)產(chǎn)物(wù)即可獲得(dé)粘端(duān)，通過(guò)粘端的(dí)連(lián)接(jiē)，可(kě)平(píng)端連(lián)接(jiē)通常情(qíng)況下，TA克(kè)隆產物(wù)可(kě)直接(jiē)與平(píng)端載體DNA進行(háng)連(lián)接(jiē)，但其連接(jiē)效率(shuài)效低。因為(wéi)TaqDNA聚合酶具有非(fēi)模(mó)板依賴(lài)性末端轉移(yí)酶活性，能(néng)在兩6條DNA鏈的3'末端(duān)加上一(yī)個多餘的(dí)鹼基，使基因合(hé)成的(dí)PCR產(chǎn)物(wù)成(chéng)為3'突出一個鹼基的(dí)DNA分子。這(zhè)種(zhǒng)DNA分子的連(lián)接(jiē)效(xiào)率很低(dī)。在采用大(dà)量(liáng)T4DNA連(lián)接(jiē)酶(méi)並(bìng)配(pèi)以(yǐ)5-10u T4 RNA連(lián)接酶(méi)時，可(kě)顯著(zhù)提高(gāo)其連接效率(shuài)。對(duì)於(yú)較短PCR產物(wù)，用PUS19的HincⅡ位(wèi)點進行克(kè)隆(lóng)，以(yǐ)X－gal和IPTG篩(shāi)選，常(cháng)可得到(dào)足(zú)量重組子。另(lìng)一(yī)種提(tí)高(gāo)克隆效率的途徑是(shì)先用Klenow大片段或T4DNA聚(jù)合酶消去3'末端(duān)突(tū)出鹼基將TA克(kè)隆(lóng)產(chǎn)物變成(chéng)平端(duān)DNA，然(rán)後(hòu)再(zài)用(yòng)平端(duān)連接法(fǎ)克隆(lóng)克(kè)隆產(chǎn)物。引物決定克隆擴增(zēng)產物的(dí)特(tè)異(yì)性與長(cháng)度。因(yīn)此(cǐ)，引(yǐn)物設(shè)計決定(dìng)PCR反應的成敗。
 
　　TA克隆主(zhǔ)要(yào)是(shì)對(duì)基因的染色體(tǐ)上(shàng)具有一定座位(wèi)的遺傳單位，是(shì)DNA分子(zǐ)中一(yī)定長度(dù)的核苷酸序列。植物的生長(cháng)發(fā)育是(shì)在多(duō)種(zhǒng)代謝(xiè)和生理(lǐ)過(guò)程基礎(chǔ)上所(suǒ)發(fā)生(shēng)的基(jī)因(yīn)在(zài)時(shí)空上表(biǎo)達(dá)的(dí)綜合(hé)現(xiàn)象(xiàng)，開發和分離潛在的各(gè)種有(yǒu)價值(zhí)的(dí)基(jī)因(yīn)並(bìng)深入研究其(qí)表達機理(lǐ)，對(duì)作(zuò)物(wù)品種的改(gǎi)良具(jù)有重要(yào)意義。因此(cǐ)TA克隆對植物基(jī)因(yīn)的克隆(lóng)並發展與(yǔ)之(zhī)相關(guān)的(dí)技(jì)術已引起人們的日(rì)益關(guān)注和(hé)投入(rù)，近年來其研究(jiū)方法不斷(duàn)改進，新(xīn)技(jì)術不(bù)斷湧現，這為(wéi)進一(yī)步研(yán)究諸如(rú)各種(zhǒng)調節植(zhí)物(wù)生長(cháng)發育的(dí)基因，逆境與防(fáng)御(yù)反(fǎn)應(yīng)的(dí)基因，植物細胞凋亡(wáng)的基因等提供(gōng)了新(xīn)的(dí)途徑。
 
　　TA克(kè)隆(lóng)的(dí)操作一般采(cǎi)用兩(liǎng)步(bù)法,即(jí)*個循環多以較低(dī)的退(tuì)火溫度進(jìn)行(háng)擴增,後20個循環則(zé)采用(yòng)較高(gāo)的退火溫(wēn)度(dù)擴(kuò)增。TA克隆產(chǎn)物多較短(duǎn),一般(bān)需(xū)高(gāo)濃度(dù)的瓊(qióng)脂(zhī)糖(táng)凝(níng)膠檢(jiǎn)測,也可用聚丙烯(xī)酰(xiān)胺凝膠檢測。如(rú)擴(kuò)增的模板(bǎn)為(wéi)mRNA,通過(guò)比(bǐ)較擴增(zēng)產物的(dí)強(qiáng)度,可以(yǐ)得(dé)知(zhī)該(gāi)基因在2種生物或同一(yī)生物不(bù)同發育階段的(dí)表達強度(dù)。另外(wài),在(zài)TA克隆檢測到(dào)與某(mǒu)一表型相(xiāng)關(guān)的基因或基因產(chǎn)物(wù)(mRNA)以(yǐ)後(hòu),下(xià)一步工作就是克(kè)隆出(chū)整(zhěng)個(gè)基(jī)因或(huò)mRNA。主(zhǔ)要操作(zuò)程(chéng)序為(wéi):(1)TA克隆(lóng)產物的(dí)提(tí)取，克(kè)隆及序列測(cè)定(dìng)。首先將(jiāng)克(kè)隆(lóng)檢測(cè)到(dào)的特(tè)定片段從凝膠中(zhōng)切下,提(tí)取(qǔ)DNA克隆(lóng)到適(shì)宜的載(zǎi)體(tǐ)內(如(rú)TA載(zǎi)體(tǐ)),再測定其核苷(gān)酸組成。根(gēn)據(jù)其(qí)核苷(gān)酸(suān)組成設計2個(gè)方向相反的引物(P-1,P-2,見圖2)。引物(wù)長(cháng)度多(duō)在20 nt以上(shàng)
；退火溫度在(zài)60℃以(yǐ)上(shàng)
；(2)將(jiāng)基因組(zǔ)DNA做適(shì)當(dāng)酶切,然後在(zài)其兩(liǎng)端連(lián)接(jiē)上相同的(dí)接(jiē)頭根據(jù)接頭(tóu)的(dí)序(xù)列(liè)擴增。