miRNA定量(liáng)檢(jiǎn)測的(dí)*

 　　所謂(wèi)miRNA定量檢測(cè)就是(shì)對已(yǐ)經獲得的(dí)目(mù)的(dí)DNA片段(duàn)進(jìn)行(háng)重新克(kè)隆(lóng)，其(qí)目的在(zài)於對目的DNA進行進(jìn)一(yī)步分析，或(huò)者(zhě)進(jìn)行重(zhòng)組(zǔ)改造等(děng)。miRNA定量檢測的基本過程(chéng)包(bāo)括：(1)目(mù)的DNA片段(duàn)和(hé)載體的(dí)製備；(2)目(mù)的(dí)DNA片段(duàn)和載體的連接(jiē)；(3)連(lián)接產(chǎn)物的轉化；(4)重組子篩選。
　　選擇(zé)適宜的限製(zhì)性核酸(suān)內(nèi)切(qiē)酶，消化已知目的DNA和載體，獲得綫(xiàn)性DNA，用於(yú)重組(zǔ)。根據(jù)目的DNA和載(zǎi)體的具(jù)體情(qíng)況，選(xuǎn)擇一種或者(zhě)兩種適(shì)當的限(xiàn)製酶切割，分(fēn)別產生(shēng)對稱(chēng)性(xìng)粘性末(mò)端（用一(yī)種限(xiàn)製(zhì)性(xìng)內切(qiē)酶進(jìn)行消化(huà)而(ér)產(chǎn)生帶有互(hù)補突(tū)出(chū)端(duān)），不對(duì)稱粘(nián)性末端（用兩(liǎng)種不同的(dí)限製性內切(qiē)酶進行(háng)消化(huà)而(ér)產(chǎn)生帶(dài)有(yǒu)非互補(bǔ)突出端），平(píng)端。在miRNA定量(liáng)檢測時，不(bù)對(duì)稱(chēng)相(xiāng)容末(mò)端連接(jiē)，次選對(duì)稱(chēng)性粘(nián)性相容性末端連接，由(yóu)於(yú)平末(mò)端連接(jiē)效(xiào)率較(jiào)低，通常很少(shǎo)采用(yòng)。但(dàn)有(yǒu)時目(mù)的(dí)片段的(dí)末(mò)端與載體不匹(pǐ)配 ，一般先將(jiāng)不匹(pǐ)配末(mò)端補平(píng)，然後(hòu)再以平(píng)末端(duān)連接(jiē)。
　　miRNA定量檢測(cè)實驗(yàn)注意事(shì)項
　　（一）定量檢測(cè)實驗(yàn)對(duì)照設置
　　為使miRNA定(dìng)量(liáng)檢測(cè)實驗成功(gōng)，並(bìng)能在未獲得(dé)目(mù)的克(kè)隆(lóng)時(shí)，查明實驗失敗的原因，每次(cì)實驗(yàn)應包(bāo)括相應(yīng)的(dí)對(duì)照。其中包括感受態細胞的(dí)轉化(huà)效(xiào)率(shuài)，抗菌素是(shì)否(fǒu)有效，連(lián)接的(dí)效率(shuài)，未連接質粒的(dí)背(bèi)景(jǐng)，磷酸酶處理(lǐ)的效(xiào)果等。
　　（二）miRNA定(dìng)量檢(jiǎn)測檢測連接(jiē)反應的(dí)效果的(dí)對照實(shí)驗
　　為(wéi)檢測連接反應的效果，綫(xiàn)化（單限(xiàn)製(zhì)性酶(méi)切(qiē)，非磷(lín)酸酶處理）質(zhì)粒需同實(shí)驗樣(yàng)品平(píng)行連(lián)接(jiē)。取一(yī)部(bù)份(fèn)連(lián)接(jiē)反應液(yè)用於(yú)轉(zhuǎn)化(huà)，隨後塗(tú)布到選(xuǎn)擇培(péi)養基(jī)上。平板(bǎn)上所生長的菌落數(shù)，可(kě)同相(xiāng)同量，未(wèi)連(lián)接的綫化質粒(lì)，轉化(huà)相同(tóng)數目(mù)的細(xì)菌後，塗(tú)布在選(xuǎn)擇培養(yǎng)基上(shàng)所(suǒ)生長(cháng)的(dí)菌落數(shù)比較。如(rú)果連接成功，自連(lián)接質粒在(zài)平板(bǎn)上的菌落(là)數，miRNA定量(liáng)檢測(cè)會(huì)遠(yuǎn)遠高於未連接的(dí)綫化(huà)質(zhì)粒轉化細(xì)菌(jūn)所(suǒ)得的菌(jūn)落數。如果綫(xiàn)化(huà)成功，未(wèi)連(lián)接(jiē)的(dí)綫(xiàn)化(huà)質粒(lì)（未連(lián)接的(dí)質粒(lì)背景(jǐng)）所(suǒ)得的(dí)菌落(là)數(shù)應很低。如miRNA定(dìng)量檢(jiǎn)測(cè)連接(jiē)效率(shuài)高(gāo)，則自連質粒所得的(dí)菌落(là)數應同用(yòng)完整質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌所(suǒ)得(dé)的菌落(là)數(shù)相(xiāng)近(jìn)。 另一(yī)種非定量(liáng)的(dí)方法是將(jiāng)等(děng)量的未連接質(zhì)粒和連接質粒在瓊脂(zhī)上電泳(yǒng)，連(lián)接後的(dí)樣(yàng)品的(dí)遷(qiān)移率會(huì)降低。
　　（三）miRNA定量檢(jiǎn)測連(lián)接(jiē)實(shí)驗需(xū)要優化(huà)的實驗指標
　　1，載體(tǐ)和插入(rù)片(piàn)段的(dí)摩(mó)爾(ěr)濃度(dù)比(bǐ)特(tè)別重(zhòng)要，載(zǎi)體:插入片(piàn)段的(dí)摩爾(ěr)數的(dí)變(biàn)化(huà)範(fàn)圍(wéi)可(kě)為8:1到(dào)1:16，但(dàn)通(tōng)常(cháng)的變(biàn)化範(fàn)圍(wéi)是3:1到1:3。插入(rù)片(piàn)段的長度(dù)和(hé)序(xù)列的變化(huà)會(huì)影響和同(tóng)一(yī)載體(tǐ)的連接(jiē)效果。每(měi)一(yī)個連(lián)接(jiē)反應(yīng)都需要(yào)作(zuò)實(shí)驗，來(lái)選(xuǎn)擇(zé)*的載體(tǐ)和插(chā)入(rù)片段(duàn)的(dí)摩爾(ěr)數比。在(zài)zui小的反(fǎn)應(yīng)體積(jī)中，通(tōng)常一(yī)個連(lián)接(jiē)反應(yīng)用(yòng)10~50 ng的載體DNA。
　　2，進(jìn)行連接(jiē)反(fǎn)應(yīng)時(shí)的(dí)保溫(wēn)的時(shí)間和溫(wēn)度也需(xū)優(yōu)化。一般(bān)而(ér)言，平末端連接(jiē)在(zài)22℃保溫4~16小(xiǎo)時(shí)，粘(nián)性末(mò)端(duān)在22℃保溫3小時，或4℃保(bǎo)溫16小時。大多數連(lián)接(jiē)反(fǎn)應(yīng)用(yòng)miRNA定(dìng)量檢測連接(jiē)酶，但(dàn)大腸杆菌的(dí)DNA連(lián)接酶可用(yòng)於粘性末(mò)端(duān)的連接，平(píng)末(mò)端連(lián)接(jiē)時(shí)用(yòng)此(cǐ)酶(méi)，活力較低。每次連(lián)接(jiē)反應用(yòng)1~10 Weiss單位的(dí)高(gāo)質(zhì)量(liáng)連接酶(méi)。
　　3，用於轉化連接(jiē)反應液的細菌(jūn)菌(jūn)株，以及(jí)用(yòng)於重組(zǔ)質粒擴增(zēng)的菌株，需經(jīng)挑選，細菌生長(cháng)的溫度也要挑(tiāo)選(xuǎn)。當(dāng)用pGEM載(zǎi)體克隆(lóng)大(dà)片段時（>7~8 kb），經轉(zhuǎn)化的菌(jūn)株在(zài)30℃而不是在37℃生長(cháng)，更(gēng)有利(lì)於連(lián)接。作(zuò)簡單(dān)的miRNA定(dìng)量檢測(cè)連接實(shí)驗，定量(liáng)檢測轉化效率的(dí)感受態細胞就可滿(mǎn)足(zú)克隆(lóng)需(xū)要(yào)，更高(gāo)轉(zhuǎn)化效率的感(gǎn)受態細胞可(kě)用於作比較困(kùn)難的克隆實(shí)驗(yàn)。為(wéi)提(tí)高(gāo)獲得目的克隆的機會，應用(yòng)盡(jìn)可能(néng)高(gāo)轉(zhuǎn)化效率(shuài)的(dí)感(gǎn)受(shòu)態細胞(bāo)（>108克隆/ugDNA）。 篩選重組克(kè)隆(lóng)時，需(xū)選(xuǎn)擇(zé)抗菌素的(dí)濃度(dù)。
　　不同廠家生產的miRNA定量檢測連接酶反(fǎn)應條件稍有不(bù)同，但(dàn)其產品(pǐn)說(shuō)明書(shū)上均有zui適(shì)反(fǎn)應(yīng)條件，包(bāo)括(kuò)對不(bù)同(tóng)末端性(xìng)質DNA分(fēn)子(zǐ)連接(jiē)的miRNA定(dìng)量檢測連(lián)接酶的用量(liáng)，作用溫度，時間等。同時提供(gōng)有(yǒu)連(lián)接(jiē)酶(méi)緩衝(chōng)液(yè)（10×，5×，2×），其(qí)中多已含有要(yào)求(qiú)濃度(dù)的(dí)ATP，應(yīng)避(bì)免高溫(wēn)放置和反復(fù)凍(dòng)融使(shǐ)其(qí)分(fēn)解(jiě)。目的DNA片段(duàn)製備，回收，純化時(shí)，應(yīng)避免外來DNA汙染。連接(jiē)產(chǎn)物的轉化：miRNA定量(liáng)檢測細菌細(xì)胞經特殊(shū)試劑處理後在(zài)適當(dāng)的條件(jiàn)下具(jù)有接收(shōu)外源DNA的(dí)能(néng)力，因(yīn)此(cǐ)可將上(shàng)述連(lián)接產(chǎn)物(wù)通過熱刺(cì)激(jī)或電脈(mài)衝轉(zhuǎn)化感受態細(xì)胞，當(dāng)細菌大量增殖的同時，導(dǎo)入(rù)的重組(zǔ)DNA也得(dé)到(dào)增(zēng)殖。miRNA定量檢(jiǎn)測態細(xì)胞所用離心(xīn)管(guǎn)，培養(yǎng)瓶(píng)經酸(suān)鹼(jiǎn)處理或使用(yòng)新(xīn)的，15 lbf/in2高壓(yā)滅菌(jūn)20min。白色(sè)菌(jūn)落中(zhōng)重(zhòng)組(zǔ)質粒(lì)內插(chā)入(rù)片段是否(fǒu)是(shì)目的片(piàn)段需(xū)通過鑒定。