熒光(guāng)定量PCR檢(jiǎn)測故(gù)障導(dǎo)航標(biāo)

 　　熒光定(dìng)量(liáng)PCR檢測(cè)的(dí)基本(běn)原理(lǐ)就是在(zài)PCR擴(kuò)增(zēng)過(guò)程中(zhōng)，隨著(zhuó)PCR循環(huán)數的遞(dì)增，PCR產(chǎn)物不斷積(jī)累(léi)，熒光信號也會相應的增(zēng)加(jiā)，這樣就可以(yǐ)通過熒光強(qiáng)度(dù)的變化來(lái)對PCR反(fǎn)應(yīng)進(jìn)行實時的(dí)監測(cè)。實現基因(yīn)的相對定(dìng)量，定量和(hé)定性(xìng)分析。熒(yíng)光(guāng)定量(liáng)PCR檢測係統采用(yòng)熱電製冷(lěng)器實現金屬模(mó)塊變(biàn)溫(wēn)，即(jí)通過(guò)微(wēi)機自動控(kòng)製(zhì)電路去(qù)控製(zhì)熱電製(zhì)冷器(qì)正(zhèng)反向(xiàng)工(gōng)作(zuò)，改變(biàn)變溫金(jīn)屬模塊的(dí)溫度(dù)，熒(yíng)光(guāng)定量(liáng)PCR檢測使(shǐ)置於金(jīn)屬(shǔ)模(mó)塊裏的(dí)試(shì)管中的(dí)反應物(wù)達到PCR的要求(qiú)。參照圖1，熱(rè)循環(huán)單元包(bāo)括可插放(fàng)若幹個(gè)試管的變溫(wēn)金屬(shǔ)模(mó)塊，熱(rè)電製(zhì)冷器(qì)，散熱(rè)器(qì)，風(fēng)扇，熱蓋(gài)。風(fēng)扇(shàn)，散熱器(qì)和熱電(diàn)製冷(lěng)器(qì)依(yī)次從兩邊(biān)緊貼變溫金(jīn)屬(shǔ)模(mó)塊，由於(yú)熱電製(zhì)冷(lěng)器采(cǎi)用兩麵緊貼(tiē)的結構，因此熒光(guāng)定量PCR檢測與(yǔ)普通將熱電(diàn)製(zhì)冷器(qì)貼(tiē)在(zài)模(mó)塊底(dǐ)部的(dí)結(jié)構比較，單位麵(miàn)積(jī)的加熱或製(zhì)冷(lěng)功(gōng)率更大(dà)，溫度變化的速度也(yě)更(gēng)高，試(shì)管(guǎn)的上(shàng)方(fāng)設有防止試管內反(fǎn)應物(wù)蒸(zhēng)發的熱蓋(gài)。在(zài)變(biàn)溫金(jīn)屬模塊(kuài)和熱蓋中分別(bié)設有溫度(dù)傳感器(qì)，傳感(gǎn)器將溫(wēn)度信號輸給控製單(dān)元。
　　該熒光定(dìng)量(liáng)PCR檢測的(dí)主(zhǔ)要(yào)優點(diǎn)：
　　1，背(bèi)景(jǐng)幹淨：自(zì)主(zhǔ)知(zhī)識產權的(dí)不形(xíng)成二聚(jù)體的(dí)引物設計(jì)使PCR反應(yīng)背(bèi)景(jǐng)幹淨(jìng)。
　　2，靈敏度(dù)高：由於(yú)采(cǎi)用(yòng)熒光染料(SYBR Green I )，靈(líng)敏度高(gāo)熒光探(tàn)針PCR一個數量級。
　　3，操作簡(jiǎn)便：熒光定量PCR檢測逆(nì)轉錄(lù)(RT)-實(shí)時熒光擴增(PCR)兩步合並(bìng)單(dān)管(guǎn)反應。
　　4，特(tè)異性高：由於選(xuǎn)取(qǔ)引(yǐn)物序列(liè)具有代表性(xìng)，經(jīng)過多(duō)次的實(shí)驗(yàn)，特(tè)異性高(gāo)。
　　5，價(jià)格(gé)便(biàn)宜(yí)：由於(yú)采用熒光染(rǎn)料(liào)，價(jià)格(gé)比(bǐ)TaqMan探(tàn)針(zhēn)方法低。
　　熒(yíng)光定量PCR檢測常(cháng)見故障維修：
　　故障1機(jī)器(qì)程(chéng)序運行中(zhōng)出現“PCR．EXE程序出(chū)錯”，點擊(jī)後程(chéng)序關(guān)閉(bì)，檢測(cè)結(jié)果丟失(shī)。
　　造(zào)成這(zhè)種故(gù)障的原因是232接口(kǒu)不(bù)良，熒光定量PCR檢(jiǎn)測(cè)係(xì)統(tǒng)在(zài)通訊時(shí)對232接(jiē)口(kǒu)的(dí)讀寫出(chū)現(xiàn)錯(cuò)誤(wù)，就會(huì)出(chū)現以上(shàng)報警。將232接(jiē)口固定(dìng)緊或(huò)重(zhòng)新焊接(jiē)即可解(jiě)決。
　　故(gù)障2 無(wú)試(shì)管(guǎn)狀態(tài)下各孔的(dí)熒(yíng)光(guāng)值(zhí)差(chà)異(yì)增(zēng)大。這(zhè)種現象是因(yīn)為(wéi)試管(guǎn)孔或熱蓋被汙染(rǎn)，這(zhè)時(shí)需要清除(chú)試管孔或熱蓋(gài)上的汙(wū)物(wù)。清除汙(wū)物(wù)時用毛(máo)刷沾少量*清(qīng)洗(xǐ)模塊(kuài)上(shàng)的(dí)錐(zhuī)孔(kǒng)及(jí)熱蓋(gài)，保證熒光定量(liáng)PCR檢測試(shì)管與(yǔ)錐孔壁(bì)接(jiē)觸(chù)充分，導熱良(liáng)好(hǎo)，避免(miǎn)汙染(rǎn)。表麵如有汙跡(jì)，還(huán)可用軟(ruǎn)布沾(zhān)清(qīng)潔膏(gāo)清洗。注意(yì)在儀器(qì)進行清洗(xǐ)時(shí)，必須切斷電(diàn)源，清洗(xǐ)模塊(kuài)上的錐孔時(shí)嚴禁(jīn)將(jiāng)清洗(xǐ)劑滴入(rù)孔(kǒng)內(nèi)。
　　故障3個別熒光曲(qū)綫突然(rán)(較(jiào)大(dà))下(xià)降。造成這種故障(zhàng)的(dí)原(yuán)因主(zhǔ)要是(shì)試(shì)管內(nèi)留有(yǒu)氣(qì)泡，由(yóu)於溫度升高後(hòu)可(kě)能(néng)會造成(chéng)氣泡(pào)破裂(liè)，熒(yíng)光定量PCR檢(jiǎn)測(cè)使(shǐ)熒(yíng)光值突(tū)變(降(jiàng)低(dī))，因(yīn)此(cǐ)處理樣本時要注意離心，振蕩均匀，把(bǎ)離(lí)心(xīn)管(guǎn)放置儀器內(nèi)時(shí)要檢(jiǎn)查(chá)試管(guǎn)內(nèi)是(shì)否有氣泡(pào)。
　　故障(zhàng)4模(mó)塊(kuài)降(jiàng)溫速度(dù)明顯(xiǎn)變(biàn)慢。造成這種(zhǒng)現(xiàn)象的(dí)原因有(yǒu)通風(fēng)孔(kǒng)被(bèi)阻塞(sāi)，連接(jiē)綫鬆動(dòng)，風機損壞或(huò)不運轉(zhuǎn)，溫(wēn)度傳(chuán)感(gǎn)器損壞(huài)，製(zhì)冷片損(sǔn)壞。經(jīng)檢查(chá)發(fā)現熒光定(dìng)量PCR檢測(cè)不運轉(zhuǎn)，導致散(sàn)熱(rè)效(xiào)果變差，模(mó)塊降(jiàng)溫(wēn)速度變(biàn)慢。更(gēng)換故障風機，機(jī)器運轉(zhuǎn)正常(cháng)。
　　故障5熱蓋無法加熱(rè)。造成這(zhè)種(zhǒng)現象(xiàng)的原因(yīn)有(yǒu)接(jiē)插件鬆動，熱蓋(gài)中(zhōng)溫度傳感器損壞(huài)，熱(rè)蓋中(zhōng)加(jiā)熱(rè)元件損(sǔn)壞(huài)。首先檢查接(jiē)頭插件(jiàn)是(shì)否(fǒu)鬆動，然後檢測(cè)熱(rè)蓋中溫度傳(chuán)感器和熱蓋中加熱元件(jiàn)，經測(cè)量(liáng)熱蓋(gài)中溫度(dù)傳(chuán)感(gǎn)器損(sǔn)壞，更換(huàn)後儀器(qì)使(shǐ)用正(zhèng)常(cháng)。
　　熒光定量PCR檢測在靶基(jī)因(yīn)被擴(kuò)增(zēng)的同時檢測反應物中的(dí)熒(yíng)光(guāng)信號的強(qiáng)度，而熒光信號的強(qiáng)度與靶基(jī)因的(dí)濃度(dù)是成(chéng)比(bǐ)例關係的(dí)，通過熒(yíng)光信號的(dí)強(qiáng)度(dù)能判斷(duàn)靶(bǎ)基(jī)因的濃度(dù)。采用(yòng)光電倍(bèi)增管檢測熒(yíng)光(guāng)強度。即通(tōng)過光(guāng)電倍增(zēng)管(guǎn)將反(fǎn)應物(wù)的熒光(guāng)信號逐一檢測，通(tōng)過(guò)信號的強弱來區分(fēn)反應物(wù)的熒(yíng)光(guāng)強(qiáng)度。熒光(guāng)定量(liáng)PCR檢(jiǎn)測(cè)部分(fēn)中(zhōng)多個濾光片的切換采(cǎi)用(yòng)了(liǎo)獨立(lì)步(bù)進電(diàn)機(jī)來(lái)實現(xiàn)。長(cháng)壽命的LED激發光源發出激發(fā)光，通過(guò)濾(lǜ)光片過濾成(chéng)特定(dìng)波長(cháng)的單(dān)色(sè)光(guāng)，再通過透鏡(jìng)聚焦成平行光照射在二(èr)向分色(sè)鏡(jìng)上(shàng)，二向分色(sè)鏡(jìng)上(shàng)可以(yǐ)反射(shè)波(bō)長小(xiǎo)於一(yī)定值(zhí)的光(guāng)，因此激發(fā)光被(bèi)設(shè)計成(chéng)可(kě)以被(bèi)二向(xiàng)分色鏡(jìng)反(fǎn)射的單色光(guāng)，激發(fā)光(guāng)被反射(shè)通(tōng)過(guò)透鏡聚(jù)焦在試管的底部，熒光(guāng)定量PCR檢測(cè)特定波(bō)長的激發光束使試管內的反應物(wù)發出(chū)特(tè)定波長的熒(yíng)光，熒(yíng)光通過(guò)透鏡(jìng)照射在(zài)二向(xiàng)分色鏡上，對於波長大於一定(dìng)值(zhí)的光可(kě)以(yǐ)穿過二向分(fēn)色(sè)鏡(jìng)，因(yīn)此熒(yíng)光(guāng)設計成可以(yǐ)穿過(guò)二向(xiàng)分色鏡的(dí)波(bō)長(cháng)的光(guāng)穿過(guò)二向分色(sè)鏡，再被濾光(guāng)片過(guò)濾成特(tè)定波(bō)長的單色(sè)光(guāng)，zui後(hòu)被(bèi)光(guāng)電倍(bèi)增(zēng)管(guǎn)接(jiē)收(shōu)變成電信(xìn)號傳輸(shū)給控(kòng)製單元。濾光(guāng)片可(kě)以(yǐ)分成多個(gè)波長，用於過濾不(bù)同(tóng)波長的熒(yíng)光。步進電機正反(fǎn)向轉(zhuǎn)動帶動(dòng)同(tóng)步帶(dài)運動，從而使固(gù)定在同步帶上的熒(yíng)光(guāng)定量PCR檢測左右移動，使(shǐ)其能(néng)逐一檢測各(gè)個試管(guǎn)的(dí)熒(yíng)光(guāng)，同時通(tōng)過撞擊左右(yòu)側(cè)麵的(dí)定(dìng)位板切換濾光(guāng)片。
　　熒光定量PCR檢測(cè)熱(rè)循環單元置於(yú)箱體(tǐ)內(nèi)的(dí)上部，熒光(guāng)檢測單(dān)元(yuán)置於其下(xià)部(bù)，控製單(dān)元位於(yú)箱(xiāng)體的後部，它執行數(shù)據(jù)處理單(dān)元通過(guò)信(xìn)號綫傳輸過來(lái)的(dí)指令(líng)信(xìn)號來控(kòng)製熱(rè)循(xún)環單(dān)元和熒(yíng)光檢測單(dān)元(yuán)按(àn)要求工(gōng)作(zuò)，同時(shí)又(yòu)將控製熱循環單元和熒(yíng)光(guāng)檢(jiǎn)測(cè)單元中(zhōng)溫度傳感器和(hé)光(guāng)電倍增(zēng)管的信號處(chǔ)理(lǐ)成(chéng)數(shù)字(zì)信(xìn)號通(tōng)過信號綫(xiàn)傳(chuán)輸(shū)給(gěi)數(shù)據處(chǔ)理(lǐ)單元，熒光定量PCR檢測數(shù)據(jù)處理單元(yuán)再將這(zhè)些信號(hào)處理成(chéng)直觀易懂(dǒng)的曲綫或圖表在PC機(jī)的(dí)顯(xiǎn)示屏上(shàng)顯(xiǎn)示出(chū)來。