miRNA定(dìng)量檢(jiǎn)測如(rú)何(hé)達到Z佳效(xiào)果

 　　miRNA定量檢測(cè)在(zài)優化條件下(xià)將陽離子(zǐ)脂(zhī)質體(tǐ)試劑(jì)加(jiā)入(rù)水(shuǐ)中時，其可(kě)以形(xíng)成(chéng)微小的（平均(jūn)大(dà)小約100-400nm）單層脂質體。這些脂質(zhì)體帶正電(diàn)，可(kě)以靠(kào)靜(jìng)電作用結(jié)合(hé)到(dào)DNA的(dí)磷(lín)酸骨架上(shàng)以(yǐ)及帶負(fù)電的(dí)細胞(bāo)膜表麵。因(yīn)此miRNA定量(liáng)檢測(cè)使(shǐ)用(yòng)陽離(lí)子(zǐ)脂質體(tǐ)轉染的(dí)原(yuán)理(lǐ)與以(yǐ)前利用中性(xìng)脂質體(tǐ)轉(zhuǎn)染的(dí)原(yuán)理不同。使用陽離子脂質體試(shì)劑(jì)，DNA並沒(méi)有預先(xiān)包(bāo)埋在(zài)脂質體中，而是帶負電的(dí)DNA自(zì)動結合(hé)到帶(dài)正電的脂(zhī)質體上(shàng)，形成(chéng)DNA-陽離子脂質體復(fù)合物(wù)。據(jù)稱，miRNA定量(liáng)檢測一(yī)個約(yuē)5kb的(dí)質(zhì)粒會結(jié)合2-4個脂質(zhì)體(tǐ)。被(bèi)俘獲的DNA就會(huì)被導入培養(yǎng)的細胞(bāo)。現存對DNA轉(zhuǎn)導原理的證據(jù)來源(yuán)於內吞體(tǐ)和(hé)溶(róng)酶體(tǐ)。
 
　　對於(yú)miRNA定(dìng)量檢(jiǎn)測(cè)，可以(yǐ)采用(yòng) RT-PCR，實(shí)時定量PCR，和Northern Blot等方法進(jìn)行(háng)檢測(cè)，通過信號(hào)強弱判(pàn)斷目(mù)的基(jī)因(yīn)的(dí)沉默效(xiào)果。值(zhí)得(dé)注(zhù)意(yì)的是(shì)在進行(háng)實(shí)時(shí)定(dìng)量(liáng)PCR時，cDNA合成要用(yòng)oligo(dT)【oligo(dT)，一種引(yǐn)物(wù)，cDNA合(hé)成(chéng)zui常用的(dí)引物是與真(zhēn)核細胞miRNA定(dìng)量(liáng)檢測分子(zǐ)3'端(duān)poly(A)結(jié)合的12-18核苷(gān)酸(suān)長(cháng)的oligo(dT)】，而(ér)不(bù)是(shì)隨機引(yǐn)物，且預擴增片段位(wèi)於靶miRNA定量檢測序(xù)列中siRNA位點的上遊，由(yóu)於(yú)功能的執行者(zhě)是(shì)蛋白(bái)，因(yīn)此還需要(yào)對(duì)蛋白(bái)水平進行檢(jiǎn)測(cè)，可通(tōng)過Western Blot，熒光免(miǎn)疫檢驗(yàn)法，流式細胞(bāo)分析術(shù)，ELISA和表型分析(xī)等(děng)方法(fǎ)來檢測幹(gān)擾(rǎo)效果。然而miRNA定量檢(jiǎn)測(cè)zui大以及(jí)zui終的(dí)效果是(shì)細(xì)胞(bāo)的代(dài)謝(xiè)過(guò)程，生(shēng)理生(shēng)化係數(shù)等表(biǎo)型(xíng)參數(shù)發(fā)生明(míng)顯的變化。
 
　　miRNA定(dìng)量檢(jiǎn)測(cè)一(yī)般(bān)在轉(zhuǎn)染後24小(xiǎo)時(shí)內發生(shēng)，其引發基因沉(chén)默的(dí)程(chéng)度和持續時間依(yī)賴(lài)於(yú)靶(bǎ)蛋白質(zhì)的(dí)降解率(turnover rate of the protein) 以及siRNA在(zài)細胞內的壽命以(yǐ)及其逐(zhú)漸(jiàn)被(bèi)稀(xī)釋的程度。由(yóu)於(yú)miRNA定量檢(jiǎn)測(cè)是(shì)進(jìn)入細胞(bāo)後(hòu)才能(néng)對(duì)蛋白的表(biǎo)達(dá)進行(háng)抑製，因此(cǐ)如(rú)何地將定量(liáng)檢(jiǎn)測轉入細(xì)胞也(yě)是成(chéng)功抑(yì)製(zhì)基因(yīn)表(biǎo)達(dá)的關鍵步驟。例(lì)如，一個siRNA分子(zǐ)對某特定基(jī)因的抑製效(xiào)率為(wéi)90%，而(ér)轉染效率(shuài)為(wéi)10%，那(nà)麼(mó)zui後(hòu)抑(yì)製蛋(dàn)白表達(dá)zui後的(dí)效率(shuài)隻有9%，可(kě)見(jiàn)如何(hé)提(tí)高miRNA定(dìng)量檢測(cè)的轉染效(xiào)率非(fēi)常(cháng)重(zhòng)要。
 
　　1，對每個(gè)基因設計(jì)並檢測(cè)兩到(dào)四個siRNA序列
：為了(liǎo)找(zhǎo)到潛(qián)在靶(bǎ)位(wèi)點，掃描(miáo)靶基(jī)因(yīn)中的AA序列(liè)。記錄(lù)每個AA 3’端19個核(hé)苷(gān)酸作為潛在siRNA靶(bǎ)位點。潛(qián)在靶位(wèi)點需通過GENBANK數據(jù)庫的BLAST分(fēn)析(xī)，去除那(nà)些與其(qí)它(tā)基(jī)因明顯(xiǎn)同源(yuán)的靶位(wèi)點(diǎn)。如果可能，siRNA應(yīng)根據(jù)miRNA定(dìng)量(liáng)檢測低(dī)二級(jí)結構(gòu)的(dí)區域(yù)設計(jì)。
 
　　2，選擇低(dī)GC含量的(dí)siRNA
：GC含量在40～55%的(dí)siRNA比(bǐ)GC含量(liáng)在(zài)55%以上的(dí)siRNA活性高(gāo)。
 
　　3，miRNA定(dìng)量檢測純(chún)化體(tǐ)外轉(zhuǎn)錄siRNA，在轉(zhuǎn)染(rǎn)前要確認siRNA的(dí)大小(xiǎo)和(hé)純(chún)度
：為(wéi)得到(dào)高(gāo)純度(dù)的siRNA，推(tuī)薦用(yòng)玻(bō)璃(lí)纖維(wéi)結(jié)合，洗(xǐ)脫（Ambion siRNA體外合成試劑(jì)盒中(zhōng)已包(bāo)括純化柱(zhù)保(bǎo)證(zhèng)siRNA純度(dù)）或(huò)通(tōng)過(guò)15-20%丙烯酰(xiān)胺(àn)膠(jiāo)除去反應(yīng)中多餘的核苷(gān)酸，小的寡核(hé)苷(gān)酸(suān)，蛋白和(hé)鹽(yán)離子(zǐ)。注(zhù)意
：化(huà)學(xué)合成的miRNA定量檢測(cè)通(tōng)常(cháng)需(xū)要跑膠電(diàn)泳(yǒng)純化(huà)【即聚丙(bǐng)烯酰胺(àn)凝(níng)膠(jiāo)電(diàn)泳法（PAGE）膠純(chún)化】。
 
　　通過體(tǐ)外轉錄的(dí)方法(fǎ)可以合成(chéng)miRNA，這樣的成(chéng)本相對化(huà)學(xué)合(hé)成法而言比較(jiào)低(dī)，是一種(zhǒng)性價(jià)比高的(dí)篩選miRNA定(dìng)量(liáng)檢測的好方(fāng)法。更重要的是采(cǎi)用這種(zhǒng)方法能(néng)夠(gòu)比化學合(hé)成法(fǎ)更(gēng)快(kuài)的得(dé)到miRNA。以(yǐ)Silencer siRNA Construction Kit為例，一旦得(dé)到DNA Oligo模版(bǎn)（這個還(huán)是需要(yào)DNA合成(chéng)的(dí)，不過(guò)DNA合(hé)成(chéng)的成本(běn)就比較(jiào)低了），隻要24小時(shí)就可以，不(bù)需(xū)要等很久。這(zhè)個(gè)方法的不足之處是實驗(yàn)的(dí)規模(mó)受到限製，雖然一(yī)次體外(wài)轉錄合(hé)成能提(tí)供足(zú)夠做(zuò)數百(bǎi)次(cì)轉染的miRNA定量檢(jiǎn)測(cè)，但是(shì)反應規模(mó)和量始終(zhōng)有一(yī)定的限製(zhì)。而且和化學合成相比，還(huán)是(shì)需要(yào)占(zhān)用(yòng)研(yán)究人(rén)員相當(dāng)的(dí)時間。畢竟，化(huà)學(xué)合成(chéng)隻需要定(dìng)購(gòu)就可以(yǐ)了。值得(dé)一提的是miRNA定量(liáng)檢測通過體外轉錄(lù)得到(dào)的miRNA隻(zhī)要較(jiào)低(dī)的(dí)濃度(dù)就可(kě)以達到(dào)化學(xué)合(hé)成(chéng)較高(gāo)濃度得(dé)到的(dí)效果。