生物(wù)顯(xiǎn)微(wēi)鏡的內(nèi)反(fǎn)射熒光(guāng)技(jì)術(shù)原理(lǐ)

　　生物顯微鏡(jìng)的內反(fǎn)射熒光技(jì)術原理
　　生(shēng)物(wù)顯微(wēi)鏡(jìng)的內反射熒光技術利用全(quán)內反(fǎn)射產(chǎn)生(shēng)的消(xiāo)逝波激發(fā)樣(yàng)品
，使樣(yàng)品表麵數(shù)百納(nà)米厚的(dí)薄(báo)層內的熒光(guāng)團受(shòu)到激發(fā)
，再(zài)用(yòng)高靈敏度(dù)和高時間(jiān)分(fēn)辨(biàn)率的(dí)攝(shè)像機(jī)CCD來捕捉(zhuō)熒光(guāng)並用(yòng)計算(suàn)機(jī)進(jìn)行顯(xiǎn)像
，從(cóng)而(ér)實現對(duì)生(shēng)物(wù)樣品觀測(cè)的(dí)一種新(xīn)生(shēng)技術(shù)。由於消逝波(bō)特點(diǎn)及(jí)CCD的(dí)優(yōu)勢使全(quán)內反(fǎn)射熒光(guāng)顯微(wēi)鏡具(jù)有高(gāo)信(xìn)噪(zào)比和高時間(jiān)分辨率(shuài)
，因此它在對(duì)單(dān)分子(zǐ)的動(dòng)態觀測具有(yǒu)很高的應用價值。
　　利用(yòng)全(quán)內反射(shè)產(chǎn)生(shēng)的(dí)消逝(shì)波激發樣品
，使(shǐ)樣品表(biǎo)麵數百納米厚的(dí)薄層內的熒光(guāng)團受到激(jī)發(fā)
，再用高靈敏度(dù)和高(gāo)時(shí)間分辨率(shuài)的攝像機CCD來捕(bǔ)捉熒(yíng)光並用計算(suàn)機進行顯(xiǎn)像(xiàng)
，從(cóng)而實現對生物樣品觀(guān)測的(dí)一種新(xīn)生技術。由(yóu)於(yú)消(xiāo)逝波特點及CCD的(dí)優(yōu)勢使全內(nèi)反射熒(yíng)光(guāng)顯微鏡(jìng)具有高(gāo)信噪比和高(gāo)時間分辨率
，因(yīn)此(cǐ)它(tā)在對單分子(zǐ)的動態觀測具(jù)有(yǒu)很(hěn)高(gāo)的應用(yòng)價(jià)值。
　　全內反射(shè)熒(yíng)光顯微(wēi)鏡根據其結構(gòu)的不同可分為(wéi)目鏡(jìng)型和棱鏡型(xíng)兩(liǎng)種。
　　1.棱(léng)鏡(jìng)型全(quán)內反(fǎn)射(shè)熒光(guāng)顯微(wēi)鏡
　　棱(léng)鏡(jìng)型(xíng)全(quán)內反(fǎn)射熒(yíng)光顯微鏡就(jiù)是(shì)利用(yòng)激光(guāng)經(jīng)過棱(léng)鏡並產生全(quán)內(nèi)反射(shè)
，其消逝(shì)波(bō)照射已被熒(yíng)光標(biāo)記的生物(wù)樣品
，其激(jī)發光從(cóng)另一側(cè)進(jìn)入(rù)目鏡(jìng)
，並被CCD相(xiāng)機(jī)捕(bǔ)捉
，其(qí)光路圖如圖所示。
　　從光路圖我(wǒ)們可(kě)以看出(chū)
，棱(léng)鏡型(xíng)係統(tǒng)在實現上(shàng)更加容(róng)易,它(tā)隻需(xū)要激(jī)光(guāng)光(guāng)源(yuán)
，棱鏡和(hé)顯微鏡(jìng)
，它也(yě)不容易受(shòu)到入射(shè)光信(xìn)號(hào)的(dí)幹(gān)擾(rǎo)
，但(dàn)由於消逝波在(zài)z軸(zhóu)方向上(shàng)呈指數衰減
，隻(zhī)能照射(shè)100nm的距離(lí)。在探測上
，放(fàng)置(zhì)樣品(pǐn)的(dí)空間(jiān)收(shōu)到(dào)棱(léng)鏡的(dí)限(xiàn)製。另外由於目(mù)鏡和(hé)物鏡(jìng)同(tóng)樣品距離近(jìn)
，因此同(tóng)其他儀器(qì)的配合也受(shòu)到限(xiàn)製。目(mù)前(qián)棱鏡型全內(nèi)反射熒光顯微鏡的發(fā)展很慢(màn)
，在科學研究中一般(bān)很少(shǎo)用到。
　　2.物(wù)鏡型(xíng)全內反射(shè)顯(xiǎn)微鏡(jìng)
　　在物鏡(jìng)型全(quán)內反(fǎn)射顯(xiǎn)微術(shù)中
，顯微(wēi)鏡的(dí)物鏡即(jí)作為收集(jí)樣(yàng)品熒光(guāng)信號的接收(shōu)器
，同(tóng)時又(yòu)作為發(fā)生全內反射的(dí)光學器(qì)件
，如圖所(suǒ)示。
　　由於細胞的典型折射(shè)率(shuài)為1.33～1.38 
，因此(cǐ)要想實(shí)現全(quán)內反(fǎn)射
，物鏡的(dí)NA必(bì)須大於1.38。表(biǎo)達式為：
　　NA = nsinθ
，nsinθ> nsinθc
　　NA為物鏡(jìng)的(dí)數值孔徑(jìng)
，n
，θ分別為(wéi)物鏡的(dí)折射率(浸沒油)和(hé)孔徑角(jiǎo)。θc為發生(shēng)全(quán)反射的臨界角。當(dāng)我(wǒ)們使用(yòng)NA值為(wéi)1. 4 的透鏡(jìng)物鏡時(shí)
，隻(zhī)有很(hěn)小(xiǎo)的一部(bù)分物(wù)鏡孔徑範圍(1.4 -1.38=0.02)可(kě)以被(bèi)利(lì)用(yòng)
，這顯(xiǎn)然(rán)增(zēng)加(jiā)了光束校準(zhǔn)的難度
，同時(shí)光束(shù)的(dí)強(qiáng)度也(yě)很難提(tí)高(gāo)。如(rú)果我(wǒ)們使(shǐ)用(yòng)NA=1. 65的透鏡物鏡
，則有(yǒu)一個(gè)大(dà)的多的孔徑範圍(1.65-1.38=0.27)可被利用
，即有更多(duō)的(dí)激(jī)發光強可以用(yòng)來(lái)產生(shēng)全(quán)反射。
　　物鏡型的全內反射熒(yíng)光顯(xiǎn)微(wēi)鏡在(zài)製作(zuò)要(yào)求的技術很(hěn)高(gāo)
，它是(shì)近年(nián)來(lái)全內(nèi)反射(shè)熒光(guāng)顯微鏡的發(fā)展(zhǎn)方(fāng)向
，由於它(tā)的物鏡同(tóng)收(shōu)集樣(yàng)品熒光的(dí)儀器(qì)在同一側
，這(zhè)有(yǒu)助於同其(qí)他(tā)的(dí)儀(yí)器(qì)等(děng)的結合。
　　內反(fǎn)射熒(yíng)光顯微鏡的(dí)優勢應用和(hé)發(fā)展展望(wàng)：
　　全內(nèi)反(fǎn)射熒(yíng)光顯(xiǎn)微(wēi)鏡裏用消(xiāo)逝波(bō)作(zuò)為陽品(pǐn)的(dí)激發光源
，並(bìng)用(yòng)有(yǒu)著(zhuó)高靈敏度和(hé)高時間分(fēn)辨(biàn)率的CCD相機捕(bǔ)捉樣品(pǐn)熒光
，因此具有如(rú)下(xià)優(yōu)點(diǎn)：
　　1.信(xìn)噪比(bǐ)高(gāo)(相對(duì)共聚(jù)焦(jiāo)顯(xiǎn)微鏡(jìng));
　　2.分(fēn)辨(biàn)率高(gāo)(相(xiāng)對其(qí)他的光學顯(xiǎn)微鏡);
　　3.對(duì)生物樣本損(sǔn)傷(shāng)小(xiǎo)(相對(duì)電(diàn)鏡)
，可以進行(háng)活(huó)體(tǐ)物(wù)質的研究和單分(fēn)子的動態(tài)研(yán)究(jiū)。
　　全內反(fǎn)射熒(yíng)光(guāng)顯微術正是憑借其(qí)*的優勢(shì)
，它的熒光激發深(shēn)度隻(zhī)在～100nm的(dí)薄層範圍內(nèi)
，從而(ér)成(chéng)為(wéi)研(yán)究細胞(bāo)表麵(miàn)科學如(rú)生物(wù)化學動力(lì)學(xué)
，單分(fēn)子(zǐ)動(dòng)力(lì)學的前途的光學(xué)成(chéng)像技術。
　　全(quán)內反射(shè)熒光顯微成像法不(bù)再采用(yòng)掃描(miáo)成(chéng)像
，大大(dà)提(tí)高了成(chéng)像速度(dù)
，可(kě)以(yǐ)滿足實時成像(xiàng)的要(yào)求(qiú);另(lìng)一方麵(miàn)它(tā)的圖(tú)像(xiàng)解釋相(xiāng)對於(yú)近場
，幹(gān)涉(shè)顯微(wēi)成像(xiàng)來(lái)說(shuō)也較簡單。