酶(méi)切(qiē)鑒定(dìng)

    限製(zhì)性(xìng)內切酶是一種工具酶(méi)，這類酶(méi)的特點(diǎn)是具(jù)有(yǒu)能(néng)夠(gòu)識別雙鏈(liàn)DNA 分子(zǐ)上的特異(yì)核苷(gān)酸(suān)順(shùn)序的能(néng)力(lì)，能(néng)在這個特(tè)異(yì)性核(hé)苷(gān)酸序(xù)列(liè)內，切斷DNA 的雙鏈，形(xíng)成(chéng)一定長度和順(shùn)序(xù)DNA 片(piàn)段。對(duì)環(huán)狀質粒(lì)DNA有(yǒu)多(duō)少切(qiē)口(kǒu)，就能(néng)產生多少(shǎo)酶(méi)切片段，因此鑒定酶切(qiē)後(hòu)的(dí)片(piàn)段在(zài)電泳凝膠的(dí)區帶數(shù)，就可以推斷酶(méi)切口(kǒu)的(dí)數(shù)目(mù)，用(yòng)已知分子(zǐ)量(liáng)的綫狀DNA 為對照(zhào)，從片(piàn)段的(dí)遷移率可(kě)以大(dà)致判(pàn)斷酶切片段大小的(dí)差(chà)別(bié)。

酶切(qiē)鑒(jiàn)定操(cāo)作步驟(zhòu)
1．培養細(xì)菌
將帶有質(zhì)粒的大(dà)腸(cháng)杆菌(jūn)DH5α接種(zhǒng)在LB 瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24~48h。
2．從(cóng)細(xì)菌中(zhōng)快速(sù)提取(qǔ)製備(bèi)質(zhì)粒(lì)DNA。

3．質粒DNA 的(dí)酶(méi)解(jiě)
將自(zì)提(tí)質(zhì)粒加(jiā)入(rù)20μL 的 TE 緩衝液(yè)，使(shǐ) DNA *溶解(jiě)。取(qǔ)清(qīng)潔，幹燥(zào)，滅(miè)菌的離心管編號用(yòng)微量(liáng)加樣(yàng)器(qì)按各(gè)種試(shì)劑分別(bié)加入每(měi)個離心管(guǎn)內(nèi)。
4.DNA酶(méi)切加樣要求：

   1）.選擇合適(shì)的酶切(qiē)位(wèi)點(diǎn)，並找(zhǎo)到(dào)*緩衝液(yè)的(dí)酶(méi)切(qiē)Buffer，可保(bǎo)證(zhèng)幾乎(hū)100%的酶活性(xìng).

   2）.每(měi)小時(shí)10-15U/ul的酶(méi)可(kě)以酶(méi)切(qiē)1ug的質粒(lì)DNA,按照比例(lì)計算(suàn)酶(méi)的(dí)使用量，酶量的加倍(bèi)，可適當減(jiǎn)少酶切時(shí)間。

   3）.質(zhì)粒DNA的(dí)量通(tōng)常在反(fǎn)應(yīng)體係(xì)中(zhōng)擴(kuò)大(dà)10倍量，確(què)保(bǎo)酶切*。1小時內，50μl反應體(tǐ)積中(zhōng)，降(jiàng)解(jiě)1μg的底物DNA所需的(dí)酶為一個活力單位。因(yīn)此酶：DNA的(dí)反應比例可以(yǐ)由(yóu)此確定。較小(xiǎo)的反(fǎn)應體積(jī)更容易(yì)受到移液(yè)器誤(wù)差的影(yǐng)響。為了(liǎo)將甘油的濃度控(kòng)製在(zài)5%以下(xià)，要注意酶的(dí)體積不(bù)要超(chāo)過(guò)總(zǒng)體(tǐ)積(jī)的10%（一(yī)般酶都(dū)貯存於(yú)50%的甘(gān)油(yóu)中(zhōng)）。 

   4）.有(yǒu)的酶要求100μg/ml的BSA以實(shí)現(xiàn)*活(huó)性。在這種(zhǒng)情(qíng)況(kuàng)下(xià)，我(wǒ)們也相(xiāng)應(yīng)提(tí)供(gōng)100X的(dí)BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶(méi)如果加了BSA也不會(huì)受(shòu)太大(dà)影響(xiǎng)。 

   5）.補(bǔ)無(wú)菌雙(shuāng)蒸水至(zhì)相(xiāng)應(yīng)體係(xì)，依實(shí)際情況(kuàng)做相應調整，加(jiā)樣後(hòu)，小心(xīn)混匀，置於(yú)37℃水(shuǐ)浴(yù)中(zhōng)，酶(méi)解(jiě)2~3h，反(fǎn)應(yīng)終止後，各酶切樣(yàng)品於冰箱(xiāng)中貯存備用。
5．DNA 瓊(qióng)脂糖凝膠電(diàn)泳
  （1）瓊脂糖(táng)凝膠的(dí)製(zhì)備(bèi)：稱取(qǔ)0.6g 瓊脂(zhī)糖，置於三角(jiǎo)瓶中，加入(rù)50 mL TBE 緩(huǎn)衝液(yè)，經微波爐加(jiā)熱全部融(róng)化(huà)後，取出搖(yáo)匀(yún)，此為1.2%的瓊(qióng)脂糖凝膠。
  （2）膠板(bǎn)的製備：將(jiāng)冷卻至(zhì)65℃左右的(dí)瓊(qióng)脂(zhī)糖凝(níng)膠液，小(xiǎo)心倒入凝膠(jiāo)液，使(shǐ)膠液(yè)緩慢(màn)展(zhǎn)開，直(zhí)到在整(zhěng)個(gè)玻璃(lí)板表麵形成均(jūn)匀的膠(jiāo)層(céng)，室(shì)溫下靜(jìng)置30 min，待(dài)凝固(gù)*後(hòu)，輕(qīng)輕(qīng)拔(bá)出(chū)樣(yàng)品槽模板，在膠板上即形(xíng)成相互(hù)隔開(kāi)的(dí)樣品槽。
  （3）加樣：用(yòng)微(wēi)量(liáng)加樣(yàng)器將(jiāng)上述(shù)樣品(pǐn)分別加入膠(jiāo)板的(dí)樣品小槽內(nèi)。每次加完一個樣(yàng)品(pǐn)，要用蒸(zhēng)餾水(shuǐ)反復洗(xǐ)淨(jìng)微量(liáng)加樣器(qì)，以(yǐ)防(fáng)止相(xiāng)互汙(wū)染(rǎn)。
6． 電泳
加(jiā)完樣品後的凝(níng)膠板，立(lì)即通(tōng)電(diàn)。樣(yàng)品進(jìn)膠(jiāo)前(qián)，應(yīng)使電流控製在(zài)20mA，樣品進(jìn)膠後電壓控製(zhì)在60~80V，電(diàn)流為40~50 mA。當(dāng)指(zhǐ)示前沿(yán)移(yí)動(dòng)至距(jù)離膠板1~2cm 處，停止(zhǐ)電泳。
7，結果與觀(guān)察
在波(bō)長為254nm 的(dí)紫外燈下，觀察(chá)DNA 存(cún)在處(chǔ)顯示(shì)出(chū)的熒光條帶(dài)。