成功完(wán)成(chéng)Western Blot檢測(cè)，必須滿(mǎn)足4個(gè)條件

 　　成功(gōng)完(wán)成(chéng)Western Blot檢測，必須滿足4個(gè)條件：
　　凝膠(jiāo)洗脫：轉移(yí)期間蛋白(bái)質(zhì)必須從凝膠中洗脫出(chū)來(lái)，如(rú)果(guǒ)蛋(dàn)白(bái)質(zhì)還截留在(zài)凝膠(jiāo)中(zhōng)，將無(wú)法在膜上進(jìn)行分析。
　　吸(xī)附到(dào)膜上：在(zài)轉移(yí)過程中蛋白質必須(xū)吸附(fù)到(dào)膜(mó)上，如果(guǒ)蛋(dàn)白不(bù)吸(xī)附，將無法在膜(mó)上(shàng)進行(háng)分析(xī)。
　　處(chǔ)理期間仍截(jié)留在(zài)膜(mó)上：在轉移後的處理過程中(zhōng)蛋(dàn)白質(zhì)必(bì)須(xū)保(bǎo)持吸(xī)附(fù)在印(yìn)跡膜上(shàng)。
　　處(chǔ)理過(guò)程中可(kě)接近：被吸附(fù)的蛋白質必(bì)須(xū)能夠與(yǔ)檢測(cè)試劑接(jiē)觸(chù)，如果蛋(dàn)白質被(bèi)掩蓋則無法檢(jiǎn)測。
　　成(chéng)功(gōng)進(jìn)行Western Blot檢測，則設(shè)置(zhì)合適正確的對(duì)照是*的，隻(zhī)要正確(què)設置了這(zhè)些對(duì)照，即可(kě)快速(sù)和準確的找到WB的(dí)問題所在(zài)，並(bìng)保證實(shí)驗結(jié)果(guǒ)的(dí)準確(què)性(xìng)和(hé)特(tè)異性(xìng)
！一般(bān)需要設置的(dí)對(duì)照如(rú)下(xià)：
　　陽性(xìng)對(duì)照：明(míng)確表(biǎo)達(dá)檢(jiǎn)測蛋白的(dí)組織(zhī)或細胞，用(yòng)於檢(jiǎn)測抗體(tǐ)的工作(zuò)效率(shuài)
　　陰(yīn)性(xìng)對(duì)照：明確不(bù)表(biǎo)達檢測蛋(dàn)白組織(zhī)或(huò)細(xì)胞，用於檢測抗(kàng)體(tǐ)的(dí)特異性(xìng)
　　二(èr)抗對(duì)照(zhào)：不(bù)加(jiā)一(yī)抗(kàng)，用(yòng)於(yú)檢測二抗(kàng)的(dí)特異(yì)性(xìng)
　　內(nèi)參(cān)對照：檢(jiǎn)測標本(běn)的質量和(hé)二抗係(xì)統
　　空白(bái)對(duì)照：不加(jiā)一抗(kàng)和(hé)二抗(kàng)；用(yòng)於檢測(cè)膜(mó)的性質(zhì)和(hé)封閉(bì)的(dí)效果
　　Western Blot檢(jiǎn)測(cè)基本過(guò)程(chéng)
　　1
，獲取(qǔ)細胞或組織裂(liè)解(jiě)物(wù)
　　1)根據(jù)檢測蛋白(bái)的位置選(xuǎn)擇(zé)合適的(dí)裂解buffer：
　　)選擇(zé)合適的蛋(dàn)白(bái)酶抑製劑，避(bì)免(miǎn)蛋白降解，從而保(bǎo)證檢測的(dí)準(zhǔn)確性
！
　　2
，蛋白(bái)定量(liáng)
　　常用(yòng)的蛋(dàn)白(bái)定(dìng)量(liáng)方(fāng)法：Bradford assay, Lowry assay 或(huò)BCA assay。定量後，可(kě)根(gēn)據情(qíng)況(kuàng)將標本保(bǎo)存(cún)在-20°C /-80°C備用，進行免(miǎn)疫沉(chén)澱（IP）或(huò)者(zhě)直接進(jìn)行電(diàn)泳(yǒng)分(fēn)離蛋(dàn)白
　　3
，電泳分(fēn)離(lí)蛋白質
　　根(gēn)據待測蛋(dàn)白狀(zhuàng)態確定電泳(yǒng)條件
　　根(gēn)據(jù)待(dài)測(cè)蛋(dàn)白分子量(liáng)大小(xiǎo)確定(dìng)凝膠(jiāo)濃(nóng)度
　　4
，轉膜(mó)
　　根(gēn)據(jù)不同的檢測目的和(hé)待測蛋白的特(tè)性(xìng),選(xuǎn)擇合適的(dí)膜類(lèi)型。常用的(dí)轉移膜類(lèi)型(xíng)有(yǒu):PVDF膜
，硝酸纖維(wéi)素膜（NC膜(mó)）和尼龍膜(mó)，其中PVDF和(hé)NC膜(mó)的使(shǐ)用頻率(shuài)zui高(gāo)。
　　5
，封(fēng)閉
　　去掉膜(mó)上多(duō)餘(yú)的非特異性結(jié)合(hé)位點，降(jiàng)低背景。常(cháng)用的(dí)封閉(bì)溶液有：含BSA或(huò)者脫脂(zhī)奶粉(fěn)的TBST或TBS
　　6
，一(yī)抗孵育(yù)
　　一(yī)抗(kàng)的(dí)選(xuǎn)擇成功(gōng)與否(fǒu)，是整個WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵：選擇一(yī)抗(kàng)有以下幾個(gè)注(zhù)意點(diǎn)：
　　選(xuǎn)擇(zé)適合(hé)檢測(cè)標本(běn)種(zhǒng)屬(shǔ)的一抗（說明書有驗(yàn)證）
　　選(xuǎn)擇(zé)適用於(yú)WB實驗方法的(dí)一抗（說明書(shū)有(yǒu)驗(yàn)證）
　　選擇單克(kè)隆(lóng)抗(kàng)體或者經過親(qīn)和純化(huà)的(dí)多克隆(lóng)抗(kàng)體
　　一(yī)抗的保(bǎo)存(cún)和使用：
　　根(gēn)據(jù)說(shuō)明書的要求(qiú)條件(jiàn)進(jìn)行(háng)抗體的保(bǎo)存；一(yī)般(bān)需要將抗(kàng)體(tǐ)分裝後(hòu)放入(rù)-20度(dù)保存，避免(miǎn)反復(fù)凍(dòng)融(róng)。
　　抗體(tǐ)的工作液現(xiàn)配(pèi)現用(yòng)，在4度(dù)保存不要超(chāo)過2周(zhōu)
　　根據說(shuō)明書(shū)推薦(jiàn)濃(nóng)度使(shǐ)用TBST稀釋(shì)一抗(kàng)。由(yóu)於(yú)實驗(yàn)室(shì)條件(jiàn)和檢(jiǎn)測(cè)方法(fǎ)等的(dí)差異(yì)，說明書(shū)推薦的稀釋(shì)比例(lì)隻作(zuò)參考，需要(yào)在(zài)說明書推(tuī)薦的(dí)濃度(dù)周邊進行多個濃度梯(tī)度(dù)的(dí)實驗檢測，然後選(xuǎn)擇信噪比(bǐ)的抗(kàng)體(tǐ)濃(nóng)度進行實(shí)驗(yàn)。如果說(shuō)明書沒有推薦濃度，可進(jìn)行(háng)多個(gè)稀釋(shì)比例(lì)進行摸索*稀(xī)釋(shì)度(dù)（1:100-1:3000）。
　　孵(fū)育條件：推(tuī)薦4°C孵(fū)育過夜(yè)（一(yī)般(bān)大於18個(gè)小時(shí)），根據(jù)抗體(tǐ)親和力(lì)不同孵(fū)育(yù)時(shí)間(jiān)有所區別
　　內參的(dí)選(xuǎn)擇和使用(yòng)：WB過(guò)程監測(cè)以及目(mù)的蛋白(bái)定量(liáng)的標準
！
　　7
，二(èr)抗孵(fū)育(yù)
　　根據(jù)說明書推(tuī)薦(jiàn)濃(nóng)度使用TBST稀釋一抗。如(rú)果說(shuō)明書沒有(yǒu)推薦濃度(dù)，可進行多個稀釋比(bǐ)例(lì)進(jìn)行摸索(suǒ)*稀(xī)釋度（1:1000-1:20000）。孵(fū)育條件(jiàn)一(yī)般為室溫1-2小(xiǎo)時
　　8
，底物(wù)孵育(yù)
　　選(xuǎn)擇顯色或者化學發光(guāng)底物(wù)。一(yī)般傾向(xiàng)於化(huà)學發光，靈(líng)敏度高且(qiě)背景(jǐng)低，節省抗體(tǐ)用(yòng)量
　　9
，結果(guǒ)分(fēn)析(xī)和(hé)檢測(cè)
　　凝膠成(chéng)像(xiàng)係(xì)統(tǒng)檢測(cè)或者(zhě)暗(àn)室曝光(guāng)到膠(jiāo)片(piàn)
　　Note：從封閉(bì)開(kāi)始，每步(bù)之間都需(xū)要(yào)用(yòng)TBST進行洗滌(dí)，3次(cì)，每次5min