腺病(bìng)毒包裝技術(shù)中的Z大難點

 　　在(zài)目(mù)前的腺(xiàn)病(bìng)毒包(bāo)裝技術中，一直(zhí)困(kùn)擾著技術人員的一(yī)大難(nán)點就是(shì)如何將外源(yuán)基(jī)因(yīn)表達框或(huò)者外源的(dí)shRNA表(biǎo)達(dá)框(kuàng)構(gòu)建至腺病毒(dú)骨架載體(tǐ)上(shàng)，如(rú)果(guǒ)是用現在(zài)比(bǐ)較常規的方法即(jí)酶切-連接的(dí)方(fāng)式(shì)將外(wài)源基因或者(zhě)shRNA表達框(kuàng)構(gòu)建(jiàn)至腺病毒(dú)骨架(jià)載體上(shàng)來(lái)進行操(cāo)作，往往成(chéng)功(gōng)率比(bǐ)較低，原(yuán)因在(zài)於(yú)
：我們知(zhī)道，腺病(bìng)毒骨架載(zǎi)體比較大（~30kb），而(ér)且載(zǎi)體中(zhōng)的一些(xiē)常用(yòng)酶切位(wèi)點幾乎(hū)都(dū)有(yǒu)多個(gè)，這就造(zào)成了低(dī)成功率的現象(xiàng)。為(wéi)此，我們需(xū)要采(cǎi)用另外一種(zhǒng)方法(fǎ)對(duì)其(qí)進(jìn)行(háng)包裝即用同源重組的方(fāng)法將外(wài)源基因或shRNA表(biǎo)達框構(gòu)建(jiàn)至腺病毒(dú)骨架(jià)載體(tǐ)上(shàng)。
　　重(zhòng)組(zǔ)腺(xiàn)病(bìng)毒的(dí)包(bāo)裝製備(bèi)
：重(zhòng)組(zǔ)腺(xiàn)病毒是從由侵染(rǎn)色(sè)斑(bān)組成單位（pfu）中分離獲得的(dí)。一(yī)個單色(sè)斑(bān)是(shì)綫(xiàn)性載體(tǐ)質粒(lì)轉染(rǎn)後在20×15 cm板(bǎn)上由293A細(xì)胞連續侵(qīn)染後被挑選和(hé)擴(kuò)增形(xíng)成(chéng)的。重(zhòng)組腺病毒可通(tōng)過(guò)超速離(lí)心(xīn)純(chún)化，並(bìng)測定(dìng)滴度及(jí)進(jìn)行(háng)PCR鑒定。純化後重(zhòng)組(zǔ)腺病毒的(dí)滴定(dìng)濃(nóng)度為1010pfu/ml，獲(huò)得(dé)的量為2-4 ml。
　　作(zuò)為現(xiàn)在(zài)比較可靠的重組病毒(dú)表達係(xì)統，腺(xiàn)病毒(dú)可(kě)用於哺乳(rǔ)細胞(bāo)中(zhōng)瞬時(shí)及高(gāo)水(shuǐ)平(píng)地(dì)表(biǎo)達shRNA或目(mù)的(dí)蛋白，並具(jù)有以(yǐ)下優(yōu)勢(shì)
：
　　1，腺病(bìng)毒(dú)可感染(rǎn)一係列哺乳(rǔ)動物細(xì)胞(bāo)，除(chú)可感(gǎn)染(rǎn)幾乎所有(yǒu)人的(dí)細(xì)胞類(lèi)型(xíng)外，還(huán)可感染(rǎn)包括大鼠，小鼠(shǔ)，兔(tù)，豬，羊(yáng)，猴(hóu)，雞(jī)等(děng)物種。
　　2，因(yīn)腺病毒的感染不依(yī)賴(lài)細胞(bāo)周期(qī)，故其(qí)既可以感(gǎn)染(rǎn)增(zēng)殖細(xì)胞也(yě)可(kě)以(yǐ)感染非(fēi)增(zēng)殖(zhí)細(xì)胞，且病毒滴度(dù)高(gāo)，可(kě)用於(yú)動物水(shuǐ)平的實驗(yàn)。
　　3，腺病毒具有(yǒu)嗜(shì)上(shàng)皮(pí)細胞特(tè)性，因大多數腫瘤細胞(bāo)均屬於上皮細(xì)胞，這使得腺(xiàn)病毒非常適(shì)合應用於(yú)基(jī)因(yīn)治(zhì)療領域。
　　4，有較(jiào)好(hǎo)的生物安全(quán)性。腺病毒攜帶(dài)的(dí)基因(yīn)不會整合到(dào)宿(sù)主(zhǔ)細胞(bāo)基因組中(zhōng)；實驗(yàn)中(zhōng)雖(suī)然(rán)會有(yǒu)一定(dìng)機率出(chū)現RCA（即復製型腺病毒(dú)），但(dàn)由於(yú)大(dà)多(duō)數(shù)成人體內都有(yǒu)針對(duì)腺(xiàn)病(bìng)毒的(dí)抗體(tǐ)，所以一般危害不大。
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