如何完成western blot檢測(cè)實驗(yàn)報告

 本公司(sī)可為您(nín)提(tí)供(gōng)專(zhuān)業的(dí)western blot檢測(cè)服務
，歡迎有需(xū)要(yào)的(dí)客戶前來(lái)咨詢。
　　western blot檢(jiǎn)測服(fú)務(wù)（蛋(dàn)白(bái)印(yìn)跡雜(zá)交）
，又(yòu)稱免疫印(yìn)跡(immunoblotting)
，是用(yòng)抗(kàng)體檢(jiǎn)測蛋白(bái)的(dí)重(zhòng)要方法(fǎ)之一(yī)
，主(zhǔ)要利(lì)用抗(kàng)原抗(kàng)體反(fǎn)應(yīng)
，目(mù)前(qián)該技術(shù)已(yǐ)經(jīng)發(fā)展(zhǎn)的十分成熟(shú)
，大(dà)多數實驗室(shì)都(dū)已(yǐ)具備western blot檢測(cè)的(dí)能力
，但(dàn)是如(rú)果想要得到(dào)一(yī)份(fèn)真實客(kè)觀(guān)。條(tiáo)理(lǐ)清晰的(dí)實(shí)驗結果就(jiù)需要我(wǒ)們(mén)花很(hěn)大功夫
，下麵小(xiǎo)編(biān)就(jiù)為(wéi)大(dà)家詳細(xì)介(jiè)紹一(yī)下(xià)關於(yú)western blot檢測服務實驗(yàn)報告的(dí)一些操(cāo)作。
　　1，蛋白質(zhì)抽提
　　1）實(shí)驗對象(xiàng)為(wéi)組織樣(yàng)品(pǐn)
，取適量(liáng)（250-500mg）新(xīn)鮮組織樣品
，加(jiā)1ml含蛋白(bái)酶抑製(zhì)劑(jì)的總蛋(dàn)白抽(chōu)提試劑（或核(hé)蛋白抽提(tí)試(shì)劑(jì)）
，匀(yún)漿後抽(chōu)提(tí)總蛋(dàn)白(bái)。
　　2）實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品
，每(měi)份樣品(pǐn)取1×106～1×107細胞(bāo)
，PBS清(qīng)洗細胞
，去(qù)PBS加(jiā)0.1ml~1ml含蛋白(bái)酶(méi)抑製劑的(dí)總(zǒng)蛋(dàn)白(bái)抽提試劑（或核(hé)蛋白抽提(tí)試劑(jì)）抽提(tí)總蛋(dàn)白。
　　2，蛋白質定量(liáng)：按KCTMBCA蛋白(bái)質定(dìng)量試(shì)劑盒(hé)操作(zuò)說(shuō)明操作(zuò)
，測定樣(yàng)品濃(nóng)度。
　　3，變性(xìng)聚丙烯酰(xiān)胺不連續(xù)凝膠(jiāo)電泳(yǒng)(SDS-PAGE)：將準備(bèi)好(hǎo)的樣品液和生物素標(biāo)記的蛋(dàn)白質分子量(liáng)標準(zhǔn)分別(bié)上樣
，標準(zhǔn)加進*個孔(kǒng)中
，電(diàn)泳(yǒng)分離(lí)蛋(dàn)白。
　　4，蛋白質轉(zhuǎn)移到(dào)硝酸(suān)纖維(wéi)膜或(huò)PVDF膜(mó)
　　5，膜(mó)的封(fēng)閉和抗(kàng)體孵(fū)育
　　1）膜在5％BSA溶(róng)液中室(shì)溫(wēn)孵育1小時以(yǐ)封閉(bì)膜上(shàng)的非(fēi)特(tè)異(yì)結(jié)合(hé)。
　　2）封閉(bì)過的(dí)膜(mó)加入一(yī)級(jí)抗(kàng)體(tǐ)室溫孵育(yù)1.5小時
，抗(kàng)原(yuán)抗體結合(hé)。
　　3）加(jiā)入HRP標記的二級抗體以結(jié)合一級抗體及HRP標記的抗(kàng)生物素抗體(tǐ)以結合分子量標準
，室溫孵育(yù)膜1小時(shí)。加(jiā)入HRP標記的(dí)GAPDH抗體(tǐ)可(kě)同時檢(jiǎn)測GAPDH含量。
　　6，結(jié)果檢(jiǎn)測：化學發光(guāng)法檢(jiǎn)測
，膜與化(huà)學發光(guāng)底(dǐ)物孵育
，經(jīng)X膠片曝光顯影(yǐng)。圖片(piàn)掃描保存(cún)為電(diàn)腦(nǎo)文件
，並(bìng)用(yòng)ImageJ分析軟件(jiàn)將(jiāng)圖片上每個特異(yì)條帶(dài)灰(huī)度(dù)值(zhí)的數(shù)字(zì)化(huà)。
　　7，數據(jù)分析(xī)：目的(dí)蛋白的(dí)灰度值除以(yǐ)內參GAPDF的(dí)灰度(dù)值以校正誤差
，所得結果代(dài)表(biǎo)某樣品的目的(dí)蛋白(bái)相對含量。
　　8，提供(gōng)實(shí)驗報(bào)告：包(bāo)括(kuò)詳細(xì)的實驗方(fāng)法(fǎ)及Western Blot實驗(yàn)結果。