詳解熒(yíng)光定(dìng)量(liáng)PCR檢測(cè)的(dí)方法(fǎ)

 本(běn)公(gōng)司提供專(zhuān)業的熒光(guāng)定量PCR檢測服(fú)務，歡迎有(yǒu)需要(yào)的(dí)客戶前來(lái)咨(zī)詢！
　　熒(yíng)光(guāng)定量PCR檢測是(shì)指(zhǐ)在PCR反(fǎn)應體(tǐ)係中加(jiā)入(rù)熒光(guāng)基(jī)團，利用(yòng)熒光信號積累(léi)實時監(jiān)測(cè)整(zhěng)個PCR進(jìn)程，zui後通過標準曲(qū)綫對(duì)未知(zhī)模板進(jìn)行定量(liáng)分(fēn)析(xī)的方法(fǎ)
。熒(yíng)光(guāng)定量PCR技術(shù)於1996年由美(měi)國Applied Biosystems公(gōng)司(sī)推出(chū)，由於(yú)該(gāi)技(jì)術(shù)不(bù)僅實現了(liǎo)PCR從定(dìng)性到定量的飛(fēi)躍(yuè)，而且(qiě)與常(cháng)規PCR相比，它具(jù)有特(tè)異性更(gēng)強(qiáng)，有(yǒu)效(xiào)解決PCR汙染(rǎn)問題，自動化程(chéng)度高(gāo)等特點，到(dào)21世紀初已得到廣(guǎng)泛(fàn)應用
。


　　熒光(guāng)定量PCR檢測的(dí)方法：
　　熒光定量PCR所(suǒ)使用(yòng)的(dí)熒(yíng)光化(huà)學可分(fēn)為兩(liǎng)種：熒(yíng)光探針(zhēn)和熒(yíng)光染(rǎn)料
。而熒(yíng)光定量(liáng) PCR 的(dí)方法相應的可分為特異(yì)類(lèi)和非(fēi)特異類兩(liǎng)類(lèi)，特(tè)異性檢測方(fāng)法是在PCR反應中利用標記熒光(guāng)染料的基(jī)因(yīn)特異寡(guǎ)核苷(gān)酸探(tàn)針來檢(jiǎn)測產物；而(ér)非特異(yì)性檢(jiǎn)測(cè)方(fāng)法(fǎ)是在在PCR反應體係中，加入過(guò)量熒光染料(liào)，熒(yíng)光染(rǎn)料特異(yì)性地摻(chān)入(rù)DNA雙鏈(liàn)後，發射出(chū)熒光信號(hào)
。前(qián)者由(yóu)於(yú)增加了(liǎo)探針的識別(bié)步(bù)驟，特異(yì)性(xìng)更高，但後(hòu)者(zhě)則簡(jiǎn)便易(yì)行
。
　　熒(yíng)光定(dìng)量PCRzui常用的方法是(shì)DNA結(jié)合染料SYBR GreenⅠ的(dí)非(fēi)特(tè)異(yì)性方法和Taqman水解探針的特(tè)異性方法(fǎ)，在這裏(lǐ)主(zhǔ)要介(jiè)紹這2種(zhǒng)方(fāng)法，其(qí)它方(fāng)法(fǎ)請參考其它熒(yíng)光定(dìng)量(liáng)PCR資料
。
　　1，非(fēi)特異性(xìng)SYBR Green I染料法
　　SYBR Green I是一種結(jié)合(hé)於(yú)所有(yǒu)dsDNA雙(shuāng)螺(luó)旋(xuán)小溝區域的(dí)具(jù)有綠色激發(fā)波(bō)長(cháng)的染(rǎn)料(liào)（結(jié)合示意圖），在遊離狀態下(xià)，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一(yī)旦(dàn)與雙(shuāng)鏈(liàn)DNA結合後，熒(yíng)光大大(dà)增強（作用(yòng)機(jī)理圖(tú)）
。因(yīn)此(cǐ)，SYBR Green I的熒(yíng)光信(xìn)號(hào)強度與雙(shuāng)鏈DNA的數量相關(guān)，可以(yǐ)根據(jù)熒光(guāng)信號檢(jiǎn)測出(chū)PCR體係存在的雙(shuāng)鏈DNA數量
。
　　2，特(tè)異性Taqman水(shuǐ)解(jiě)探針法
　　Taqman熒光(guāng)定量(liáng)技術是以(yǐ)Taqman熒光探(tàn)針為(wéi)基礎(chǔ)，Taqman熒光(guāng)探針(zhēn)為一寡核苷酸(suān)，兩端(duān)分(fēn)別(bié)標(biāo)記(jì)一個熒(yíng)光發(fā)射(shè)基團和一個(gè)熒光(guāng)淬滅基團
。探(tàn)針完(wán)整(zhěng)時(shí)，發射(shè)基團發射(shè)的熒光(guāng)信號被(bèi)淬(cuì)滅基團吸收；
　　PCR擴增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切(qiē)酶活性將探針酶切降解，使熒(yíng)光發(fā)射基團和熒(yíng)光(guāng)淬滅基團分離(lí)，從而(ér)熒光(guāng)監(jiān)測係(xì)統可接(jiē)收到熒(yíng)光信號(hào)，即(jí)每(měi)擴(kuò)增一(yī)條DNA鏈，就有(yǒu)一個(gè)熒光(guāng)分子形(xíng)成，實(shí)現(xiàn)了熒(yíng)光(guāng)信號(hào)的累積(jī)與(yǔ)PCR產物(wù)形(xíng)成(chéng)*同步(bù)
。從(cóng)而(ér)實現定量(liáng)（如下圖）
。常(cháng)用的熒光基團是FAM, TET, VIC, HEX
。