什(shí)麼是TA克(kè)隆技術

 TA克隆(lóng)技術（TA cloning）利用(yòng)Taq聚(jù)合酶具(jù)有末端(duān)轉(zhuǎn)移酶（TdT）活(huó)性，但(dàn)卻不具有3'-5'端外切(qiē)酶校(xiào)準(zhǔn)活性的(dí)特點，可(kě)在PCR產物(wù)的3'端加(jiā)上(shàng)一個(gè)非(fēi)模板依賴(lài)鹼基“A”。pMD18-T是一種(zhǒng)克隆PCR產物的載體，它是(shì)由pUC18載(zǎi)體在(zài)Xba I和(hé)Sal I識(shí)別(bié)位點(diǎn)間插(chā)入(rù)一(yī)個(gè)EcoR V位點，然(rán)後用EcoR V進(jìn)行酶切使質粒綫(xiàn)性(xìng)化，並在它的(dí)3'端(duān)添(tiān)加“T”構(gòu)建(jiàn)而(ér)成。因(yīn)其(qí)3'端帶有一(yī)個(gè)突出的“T”尾，能(néng)地(dì)與帶“A”尾(wěi)的(dí)PCR產(chǎn)物連(lián)接，極大(dà)地提高(gāo)了(liǎo)克隆(lóng)的效率。TA克(kè)隆是(shì)目前(qián)克(kè)隆(lóng)PCR產(chǎn)物zui簡便，快捷(jié)的方法。
　　TA 克隆的idea zui初來自(zì)1994 年(nián)。幾(jī)位學者發(fā)現(xiàn)Taq DNA聚合酶(méi)會在PCR產(chǎn)物的3’末(mò)端加(jiā)上(shàng)一個脫氧腺苷(gān)（A），而且這種特性(xìng)與模板(bǎn)無(wú)關(guān)。之後，Invitrogen 公司發(fā)明(míng)了(liǎo)TA 克(kè)隆技(jì)術，並(bìng)擁有(yǒu)TA cloning 商標(biāo)的(dí)權(quán)，直(zhí)至(zhì)2013 年(nián)。綫性化的(dí)T 載(zǎi)體在3’末(mò)端(duān)擁有一(yī)個脫(tuō)氧胸(xiōng)苷(gān)（T），與(yǔ)PCR 產物的A 尾(wěi)巴互(hù)補(bǔ)。原(yuán)理(lǐ)就(jiù)是這(zhè)麼(mó)簡(jiǎn)單。不(bù)過由於(yú)價格(gé)的原因(yīn)，Invitrogen 的(dí)T 載體(tǐ)在國(guó)內卻不是(shì)銷(xiāo)量(liáng)的。Promega 的(dí)pGEM-T（easy）和Takara 的(dí)pMD18-T 因性(xìng)價比(bǐ)高，更(gēng)加(jiā)深入人(rén)心(xīn)。
　　TA 克(kè)隆(lóng)的步(bù)驟無需(xū)贅(zhuì)述，相信大(dà)家都很清楚。無非就是PCR，連(lián)接(jiē)，轉化，鑒定這幾(jī)個步驟(zhòu)，不(bù)過(guò)還有一(yī)些(xiē)不(bù)得(dé)不說的問(wèn)題，值(zhí)得大(dà)家(jiā)注意(yì)。
　　1，用(yòng)什麼樣的(dí)聚合酶(méi)？
　　不是(shì)所有的聚合(hé)酶都會(huì)在(zài)PCR產物末(mò)端加A。具有3’到(dào)5’外(wài)切(qiē)酶活性的高保真(zhēn)酶(méi)就不(bù)會產(chǎn)生(shēng)A 尾巴。如(rú)果你下一步想(xiǎng)要做(zuò)基(jī)因表達(dá)，一定要用高(gāo)保真(zhēn)酶，那也沒問題(tí)。隻要用(yòng)Taq 酶在產物(wù)末(mò)端加個(gè)A 就OK。步驟也很簡單(dān)，根本無需買(mǎi)個什麼加(jiā) A 試(shì)劑盒(hé)，幾步就(jiù)搞(gǎo)定了(liǎo)。
　　1. 用(yòng)高保真酶(méi)擴增完之(zhī)後，在(zài)反應(yīng)管(guǎn)中加(jiā)入 0.7-1 unit 的Taq 聚(jù)合(hé)酶(méi)。無(wú)需(xū)更(gēng)換buffer，其(qí)中的dATP 已經夠(gòu)用。
　　2. 在72℃孵育8-10 分鐘。
　　3. 立即(jí)進行純(chún)化，沉(chén)澱，跑膠，或用純(chún)化(huà)試劑(jì)盒。這(zhè)一(yī)點相當(dāng)重要，否(fǒu)則高(gāo)保真聚合酶(méi)會(huì)將(jiāng)A 尾巴(bā)或(huò)T 載體(tǐ)上的T 尾(wěi)巴(bā)切掉(diào)。
　　有(yǒu)些率(shuài)的(dí)聚合(hé)酶其(qí)實(shí)是(shì)Taq 酶和高(gāo)保真酶的混合物(wù)，大約有(yǒu)一半(bàn)的(dí)產物加(jiā)了A 尾(wěi)巴。所以(yǐ)你在克隆之(zhī)前搞(gǎo)清楚你(nǐ)用的酶到底是否(fǒu)加 A，否則克隆出(chū)來白斑(bān)太少(shǎo)，又(yòu)要(yào)討論(lùn)好久。
　　2，PCR 產物(wù)的(dí)純度(dù)
　　如(rú)果你的PCR 產(chǎn)物隻有*條帶(dài)，恭喜(xǐ)你。不(bù)過為保險(xiǎn)起(qǐ)見，還是(shì)用(yòng)PCR 產物(wù)純(chún)化(huà)試劑(jì)盒(hé)來純化一次。否(fǒu)則(zé)白色(sè)菌(jūn)落(là)中(zhōng)的插入片段可能是引物(wù)二聚體哦(ó)。如果你發現(xiàn)有(yǒu)非(fēi)特(tè)異(yì)條(tiáo)帶，那優化(huà)一(yī)下PCR 反應，讓非特(tè)異條帶消失。跑膠純化是下策，因為膠(jiāo)純(chún)化(huà)可(kě)能會帶走3’的(dí)A 尾巴(bā)。而且注(zhù)意不(bù)要(yào)在紫外燈(dēng)下(xià)暴露太久。隻(zhī)需5 秒(miǎo)，紫外對(duì)DNA 的傷(shāng)害(hài)就足以檢(jiǎn)測(cè)；而(ér)長(cháng)達60 秒的照射(shè)會(huì)讓某(mǒu)段序列(liè)在(zài)測序(xù)時無(wú)法讀取。問(wèn)題(tí)遠比你(nǐ)想象中嚴(yán)重。
　　易生(shēng)物提(tí)示：PCR 產(chǎn)物其實(shí)也有(yǒu)保(bǎo)質期。為(wéi)了保(bǎo)證連接效率，PCR 產(chǎn)物(wù)不要(yào)超過一(yī)天。因(yīn)為上麵的(dí)A 尾(wěi)巴(bā)會隨著(zhuó)時(shí)間逐漸降(jiàng)解，導致(zhì)連(lián)接效(xiào)率(shuài)下降(jiàng)。千(qiān)萬不要為(wéi)了(liǎo)省事(shì)，就整個(gè)一(yī)大管(guǎn) PCR 產物，每次用一(yī)點。zui終反(fǎn)而(ér)更浪(làng)費(fèi)時(shí)間。
　　3，載(zǎi)體和片段的比(bǐ)例
　　這往(wǎng)往是影響(xiǎng)克隆效果的(dí)zui大(dà)因(yīn)素(sù)。通常(cháng)來說，載體與片(piàn)段的(dí)起(qǐ)始(shǐ)摩(mó)爾比(bǐ)為1：1。計算(suàn)方法(fǎ)如(rú)下(xià)：
　　X ng PCR 產(chǎn)物 = （ng 載體(tǐ) × kb 片段(duàn)大小） / kb 載體大(dà)小(xiǎo)
　　如果這樣的(dí)比例(lì)不(bù)能(néng)令你滿意，你(nǐ)可以(yǐ)在(zài)3： 1 到(dào)1：3 的範圍內進行優(yōu)化，選擇*的比(bǐ)例。 PCR 產物的濃(nóng)度(dù)可(kě)以(yǐ)通過(guò)與(yǔ)Marker 比(bǐ)對(duì)估算(suàn)出來。還有一(yī)種更(gēng)準確(què)的方法，用(yòng)GE 的NanoVue 超微(wēi)量(liáng)分光(guāng)光度計(jì)。隻(zhī)需要0.5 ul，就能測量(liáng)出(chū)樣品濃度，你再(zài)也不用舍不得珍貴的樣品了。0.5 ul 而(ér)已，小意思(sī)。