熒光(guāng)定(dìng)量PCR的原理，方法(fǎ)及(jí)結(jié)果分析

　　熒光(guāng)定量PCR的原理(lǐ)，方法(fǎ)及(jí)結(jié)果分(fēn)析(xī)
　　自K. Mullis發明聚(jù)合酶鏈式反(fǎn)應(Polymerase chain reaction，PCR)以來，PCR技術很(hěn)快成(chéng)為科(kē)研(yán)，臨床診斷的熱點技(jì)術(shù)。RT-PCR（實時熒(yíng)光定(dìng)量PCR技術(shù)）就(jiù)是在PCR的基礎(chǔ)上(shàng)加(jiā)入(rù)熒(yíng)光(guāng)基(jī)團，通(tōng)過熒光信(xìn)號的(dí)變化(huà)的(dí)實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR的反應過程，通過對未(wèi)知(zhī)模(mó)板(bǎn)進(jìn)行定量分析的方法(fǎ)。目(mù)前(qián)，實時(shí)熒光定量(liáng) PCR 已成為(wéi)不同樣品(pǐn)間(jiān)進(jìn)行(háng)基因表(biǎo)達水(shuǐ)平定(dìng)量差(chà)異比(bǐ)較的(dí)權威(wēi)性方法。在過(guò)去(qù)十幾年(nián)中，該方法迅(xùn)速(sù)流(liú)行，涉及科學的多個領(lǐng)域(yù)，包括(kuò)農業(yè)，環境，工業和醫(yī)學研究。
　　目前，qPCR技(jì)術已經(jīng)廣(guǎng)泛(fàn)應(yīng)用於(yú)疾病的早期診斷(duàn)，遺傳(chuán)病(bìng)的早期(qī)診(zhěn)斷(duàn)，藥(yào)物研(yán)究(jiū)，腫瘤(liú)的診斷與研(yán)究(jiū)，食(shí)品病(bìng)原(yuán)微(wēi)生物(wù)的檢(jiǎn)測，轉基因食(shí)品檢(jiǎn)測，動物(wù)疫(yì)病檢測等，除此(cǐ)之(zhī)外，還包(bāo)括(kuò)：
　　● 基(jī)因(yīn)擴增(zēng)
　　● 擴(kuò)增特(tè)異(yì)性分析(xī)
　　● 基(jī)因定量(liáng)分析
　　● 基(jī)因(yīn)檢(jiǎn)測
　　● 基(jī)因(yīn)分型
　　● SNP分(fēn)析
　　● RFLP多(duō)態性(xìng)分(fēn)析
　　● 單/多基(jī)因表達研(yán)究
　　● 高通(tōng)量基因(yīn)表(biǎo)達(dá)譜(pǔ)研(yán)究
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　　（1）染料法(fǎ)
　　熒光(guāng)染料可與雙鏈(liàn)DNA結合，每個循環的延(yán)伸階段(duàn)，染料摻(chān)入雙(shuāng)鏈DNA中，其熒光信號(hào)強(qiáng)度與(yǔ)PCR產物的數量呈(chéng)正(zhèng)相(xiāng)關。同時，其缺點也在於(yú)其非特異性(xìng)。當(dāng)PCR反應中有引(yǐn)物二(èr)聚體或(huò)者非特異性(xìng)擴增(zēng)時，該染料也可(kě)以和這些(xiē)非(fēi)特異(yì)性擴增產物(wù)結合，發(fā)出熒光(guāng)，從(cóng)而幹擾(rǎo)對特異性產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量。
　　常(cháng)用的染(rǎn)料(liào)為SYBR Green I，各(gè)公(gōng)司針對(duì)熒光(guāng)信號(hào)強(qiáng)度，抑製作(zuò)用等進(jìn)行(háng)改進(jìn)，也推出了很多新(xīn)的(dí)染料供(gōng)大家(jiā)選擇(zé)。
　　Promega采(cǎi)用新型(xíng)熒光染料(liào)BRYT Green? Dye，對qPCR反(fǎn)應沒(méi)有抑製作用，與(yǔ)雙鏈DNA結(jié)合後(hòu)熒光信號(hào)更強.
　　（2）探針法(fǎ)
　　在(zài)PCR擴(kuò)增時加入(rù)一對(duì)引(yǐn)物的同時加入(rù)一個(gè)特(tè)異(yì)性(xìng)的(dí)熒光探針，該探針為一寡(guǎ)核苷(gān)酸(suān)：5’端(duān)標(biāo)記(jì)一個(gè)報告熒光(guāng)基團(tuán)，3’端標記一(yī)個淬滅熒光基團(tuán)。探(tàn)針完(wán)整時，報告基團(tuán)發(fā)射的(dí)熒光信號被(bèi)淬(cuì)滅基團吸(xī)收(shōu);PCR擴增(zēng)時(shí)，Taq酶的(dí)5'-3'外切酶活(huó)性將(jiāng)探針酶切降解(jiě)，使報(bào)告熒(yíng)光基團(tuán)和(hé)淬(cuì)滅(miè)熒(yíng)光(guāng)基團(tuán)分(fēn)離(lí)，從而(ér)熒光(guāng)監(jiān)測(cè)係(xì)統可接收到熒光(guāng)信(xìn)號。
　　（3）熒(yíng)光定量
　　一(yī)般而言(yán)，熒光擴(kuò)增(zēng)曲綫(xiàn)可(kě)以分成(chéng)三(sān)個階段：熒(yíng)光背景信號階(jiē)段，熒(yíng)光信(xìn)號指(zhǐ)數擴增階(jiē)段(duàn)和(hé)平台(tái)期(qī)。在(zài)熒光背景(jǐng)信號階段，擴(kuò)增(zēng)的(dí)熒光信號被熒光(guāng)背(bèi)景(jǐng)信號(hào)所(suǒ)掩蓋(gài)，無法(fǎ)判斷(duàn)產(chǎn)物(wù)量(liáng)的(dí)變化(huà);在平台期，擴增(zēng)產(chǎn)物(wù)已不再呈(chéng)指(zhǐ)數(shù)級增加(jiā)，PCR終(zhōng)產物量(liáng)與(yǔ)起始模板量之(zhī)間(jiān)沒有綫性關係，無法計(jì)算(suàn)起始(shǐ)模(mó)板(bǎn)拷貝數。因此(cǐ)隻(zhī)有在熒光信號(hào)指數擴(kuò)增(zēng)階(jiē)段(duàn)，PCR產物量的對(duì)數值與起始模(mó)板(bǎn)量(liáng)之(zhī)間存在(zài)綫性(xìng)關係(xì)，故(gù)選(xuǎn)擇(zé)在這個階段進(jìn)行(háng)定量分(fēn)析。為(wéi)了(liǎo)定量方(fāng)便，在實時熒(yíng)光定量 PCR 技術中(zhōng)引入了幾(jī)個重要(yào)的概(gài)念(niàn)：擴(kuò)增(zēng)曲綫(xiàn)，熒(yíng)光閾值，CT值。
　　注：
　　橫(héng)坐(zuò)標：代(dài)表(biǎo)擴(kuò)增(zēng)循(xún)環數;
　　縱(zòng)坐(zuò)標：代表熒光(guāng)強度，每(měi)個循環(huán)進行一次熒(yíng)光信(xìn)號(hào)收集(jí)。
　　熒光閾值(zhí)(Threshold)
　　在(zài)熒(yíng)光擴增(zēng)曲綫上人為設定(dìng)的一個(gè)值(zhí)，它(tā)可以(yǐ)設定在熒光(guāng)信號(hào)指數擴(kuò)增階(jiē)段任(rèn)意位(wèi)置(zhì)上，但一(yī)般(bān)熒光(guāng)閾值(zhí)的(dí)設置(zhì)是PCR反應(yīng)前3-15個循(xún)環熒光信號(hào)標準偏差(chà)的10倍(bèi)。(如(rú)下圖(tú))
　　每(měi)個反應管內(nèi)的(dí)熒(yíng)光(guāng)信(xìn)號(hào)到達設(shè)定閾值(zhí)時所經歷(lì)的循(xún)環數(shù)。每(měi)個(gè)模板的Ct值與(yǔ)該模板(bǎn)的起(qǐ)始拷貝數(shù)的對(duì)數存在綫性關(guān)係(xì)，起始拷貝數越多，Ct值(zhí)越小(xiǎo)。利(lì)用已知起(qǐ)始(shǐ)拷貝(bèi)數的(dí)標(biāo)準品(pǐn)可作出標(biāo)準(zhǔn)曲綫，其中橫(héng)坐(zuò)標代表(biǎo)起始拷貝(bèi)數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐(zuò)標(biāo)代表(biǎo)Ct值。因(yīn)此，隻(zhī)要獲得未知樣(yàng)品的Ct值(zhí)，即(jí)可(kě)從(cóng)標準曲(qū)綫上計(jì)算出該樣(yàng)品(pǐn)的起始(shǐ)拷貝(bèi)數(shù)。同時，對於熒(yíng)光(guāng)PCR實(shí)驗來(lái)說，CT值也(yě)是(shì)判(pàn)讀(dú)樣品(pǐn)陰陽性(xìng)的(dí)重要指標(biāo)。(如下圖)
　　實驗室(shì)應(yīng)用(yòng)
　　PCR檢測(cè)方法在臨床醫(yī)學(xué)及實驗(yàn)室檢(jiǎn)驗中最有價值的(dí)應用(yòng)領(lǐng)域就是對(duì)感(gǎn)染性疾(jí)病的診斷。理論(lùn)上(shàng)，隻(zhī)要(yào)樣(yàng)本有一(yī)個病原(yuán)體存在(zài)，PCR方法就可以檢測到。該方(fāng)法對病原體的檢測解決(jué)了(liǎo)免疫(yì)學檢測(cè)的(dí)“窗(chuāng)口期”問題(tí)，常(cháng)用於疾病的早(zǎo)期(qī)診斷，可判斷疾(jí)病是否(fǒu)處(chǔ)於隱(yǐn)性或亞(yà)臨(lín)床(chuáng)狀(zhuàng)態。
　　大量的(dí)熒光定(dìng)量(liáng)PCR研究資(zī)料表(biǎo)明，病原體(tǐ)數量與(yǔ)感(gǎn)染性(xìng)疾(jí)病(bìng)病(bìng)情的輕重(zhòng)程(chéng)度，傳染(rǎn)性及治療效(xiào)果均(jūn)有相關性。因此，通過熒(yíng)光(guāng)定(dìng)量(liáng)PCR方(fāng)法得到(dào)的檢測結果(guǒ)，一定程(chéng)度(dù)上可(kě)以準確(què)反(fǎn)映疾(jí)病感染(rǎn)的(dí)情況(kuàng)。
　　除此之外，也可以見(jiàn)於(yú)腫瘤(liú)分子(zǐ)機製(zhì)，遺傳病篩查(chá)，樣本成分(fēn)鑒定(dìng)等(děng)多方(fāng)麵(miàn)的(dí)實(shí)際(jì)應(yīng)用中。