TA克隆專業化(huà)的藝術(shù)

 　　TA克(kè)隆(lóng)技術（TA cloning）利用Taq聚(jù)合酶(méi)具(jù)有末(mò)端(duān)轉移酶(méi)（TdT）活性(xìng)，但卻不(bù)具有3'-5'端(duān)外(wài)切(qiē)酶(méi)校準(zhǔn)活性的特點(diǎn)，可(kě)在(zài)PCR產物的3'端(duān)加上一個(gè)非模板依(yī)賴(lài)鹼基“A”。pMD18-T是一種克隆(lóng)PCR產(chǎn)物(wù)的載體，它(tā)是由pUC18載體在(zài)Xba I和Sal I識別(bié)位點間插(chā)入一個EcoR V位點，然(rán)後用EcoR V進行(háng)酶切使(shǐ)質粒(lì)綫性化，並在(zài)它(tā)的3'端添(tiān)加“T”構建(jiàn)而成。因其(qí)3'端(duān)帶有一(yī)個突(tū)出(chū)的(dí)“T”尾，能(néng)地與帶(dài)“A”尾的PCR產(chǎn)物(wù)連接(jiē)，極(jí)大(dà)地提(tí)高(gāo)了(liǎo)克隆(lóng)的效率。TA克(kè)隆是目前(qián)克(kè)隆(lóng)PCR產(chǎn)物(wù)zui簡便，快捷的方(fāng)法。
 
　　1.TA克隆技術(shù)隻需(xū)4個步驟
：①擴增(zēng)目的PCR產物
；②製(zhì)備T克隆載體
；③基(jī)因(yīn)合(hé)成產物(wù)直(zhí)接(jiē)克隆至(zhì)T載體上④轉化(huà)並篩選重(zhòng)組子。 PCR２.轉(zhuǎn)化後(hòu)無克隆(lóng)菌(jūn)產(chǎn)生(shēng)轉化過(guò)程有(yǒu)問(wèn)題或感(gǎn)受態(tài)細胞失活,可(kě)通過(guò)轉(zhuǎn)化pUC18/19等(děng)未切割(gē)的可用(yòng)於抗(kàng)性(xìng)篩(shāi)選(xuǎn)的(dí)質粒(lì)，基因合成３.插(chā)入對(duì)照(zhào)DN段(duàn)的陽性(xìng)率(shuài)低TA克隆(lóng)10×快(kuài)速連接(jiē)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)稀釋(shì)不當提供的T4 連接酶緩衝液為(wéi)十倍濃度，10μl 反應體積加(jiā)1μl T4 連接酶(méi)緩衝(chōng)液(yè)連接反應存(cún)在問題連接(jiē)緩衝(chōng)液隻(zhī)有低(dī)的活(huó)性。10×快(kuài)速連(lián)接緩衝液含有(yǒu)ATP，溫度波動(dòng)ATP 易降(jiàng)解。使用一次(cì)性分裝(zhuāng)的緩衝(chōng)液，避免(miǎn)其反復(fù)凍化定(dìng)點(diǎn)突(tū)變通過(guò)凝(níng)膠(jiāo)比(bǐ)較連接的和(hé)未連(lián)接(jiē)的DN段(duàn)並(bìng)檢查分(fēn)子量標(biāo)準(zhǔn)DN段是否被連(lián)接成高分子(zǐ)量的片段(duàn)，用(yòng)大約20ng DNA 分(fēn)子量(liáng)標準（如Lambda DNA/Hind III 分(fēn)子(zǐ)量(liáng)標準）TA克(kè)隆(lóng)建立一個(gè)連(lián)接反應(yīng)以檢(jiǎn)測連接酶(méi)及(jí)緩衝液的活(huó)力(lì)T 突出(chū)端丟失，引起載體(tǐ)平(píng)端連(lián)接(jiē)，因而藍色菌落數(shù)高(gāo)於(yú)白色菌落數(shù)避免(miǎn)核酸外(wài)切酶的(dí)引入(rù)，降(jiàng)解T 突(tū)出(chū)端(duān)。隻使(shǐ)用無外(wài)源核(hé)酸酶(méi)的T4 連接(jiē)酶，多肽合成(chéng)采用(yòng)插入對照(zhào)DN段，連接(jiē)轉化(huà)時白色(sè)克隆菌數(shù)低於(yú)60％。 10×快(kuài)速連接緩衝液(yè)稀釋不(bù)當提供的(dí)T4 連(lián)接酶緩衝液(yè)為十倍濃度，10μl 反應體積加1μl T4 連(lián)接酶緩(huǎn)衝(chōng)液T 突(tū)出(chū)端(duān)丟失，TA克隆(lóng)引起載體(tǐ)平端(duān)連接，因而藍(lán)色菌(jūn)落數(shù)高(gāo)於(yú)白色菌(jūn)落(là)數(shù)。避(bì)免核(hé)酸(suān)外(wài)切(qiē)酶(méi)的(dí)引(yǐn)入，降解T 突出端(duān)。隻使用係統自(zì)己提供(gōng)的T4 連接(jiē)酶(méi)，這(zhè)種連接酶(méi)外(wài)切酶活力(lì)zui低(dī)連(lián)接(jiē)溫度太高(gāo)連接(jiē)溫度過高（>28℃）可使背(bèi)景增(zēng)加(jiā)，使重組克隆菌減(jiǎn)少(shǎo)。降低連接溫度(dù)可以(yǐ)提(tí)高白(bái)斑率(shuài)PCR 片段(duàn)很(hěn)多(duō)沒有A 尾。將PCR 產物純化(huà)後進(jìn)行加尾反應(yīng)。樣品純(chún)化(huà)後進行(háng)連接反(fǎn)應(yīng)插(chā)入片段(duàn)
：載(zǎi)體比(bǐ)例(lì)不理想。凝膠電(diàn)泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的完整性(xìng)及(jí)產量，優化插入片(piàn)段多(duō)個(gè)PCR 產(chǎn)物被(bèi)克隆進pGM-T 或pBS-T 載體(tǐ)凝(níng)膠純(chún)化(huà)目(mù)的PCR 產物PCR 產物連接(jiē)時白色(sè)菌落數很少或(huò)根本(běn)沒(méi)有。
 
　　TA克隆 10×快速連接(jiē)緩衝液(yè)稀釋不(bù)當提供(gōng)的T4 連接(jiē)酶緩衝液為十(shí)倍濃度，10μl 反(fǎn)應體積加1μl T4 連(lián)接酶(méi)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)連接孵(fū)育(yù)時間不夠(gòu)長(cháng)連(lián)接(jiē)過夜可得到理(lǐ)想結(jié)果PCR 產(chǎn)物中含有(yǒu)抑製連接的成分，導致連(lián)接的(dí)失敗(bài)將PCR 產(chǎn)物(wù)和連接(jiē)反(fǎn)應對照混合(hé)，觀(guān)察(chá)是否存在抑製(zhì)效應。如懷(huái)疑TA克(kè)隆(lóng)有抑製成(chéng)分存在(zài)，應重新(xīn)純化PCR 產物(wù)PCR 產(chǎn)物(wù)沒(méi)有(yǒu)3’-A 突出端(duān)，不(bù)能連(lián)接。並(bìng)非所有(yǒu)DNA 聚合(hé)酶都產生3’-A 突出端(duān)，如(rú)Pfu酶的(dí)PCR產物(wù)為平(píng)端(duān)。平端PCR產物(wù)可先(xiān)通過聚(jù)合酶(méi)及dATP 進(jìn)行加(jiā)尾反(fǎn)應(yīng)產生3’-A 突(tū)出(chū)端(duān)，再與T載體(tǐ)連接，gene synthesis由(yóu)於紫外(wài)燈(dēng)過(guò)度照(zhào)射形成(chéng)嘧啶二聚體，PCR 產物不(bù)能(néng)連(lián)接。PCR 產(chǎn)物已(yǐ)經(jīng)插(chā)入(rù)，但未破壞(huài)lacZ 基因的翻譯框。插(chā)入(rù)片段(duàn)
：載體(tǐ)連(lián)接比(bǐ)例不(bù)理想(xiǎng)TA克(kè)隆DNA 重(zhòng)排檢(jiǎn)測大量克隆觀察重排(pái)是否(fǒu)是(shì)隨機(jī)的(dí)。如果是(shì)隨機(jī)重(zhòng)排，通過篩選可得(dé)到(dào)有(yǒu)目的(dí)DN片(piàn)段的克隆(lóng)菌，而如果所(suǒ)有(yǒu)克隆(lóng)是(shì)一(yī)種重(zhòng)排(pái)方(fāng)式，則需要使(shǐ)用修(xiū)補缺(quē)陷(xiàn)的菌(jūn)株保護插(chā)入片(piàn)段，減少重排事件的發生PCR 連(lián)接反(fǎn)應隻產(chǎn)生白色(sè)克隆(lóng)（沒(méi)有藍色克隆(lóng)）氨苄失活，因而(ér)氨(ān)苄敏感菌可(kě)生(shēng)長。檢查(chá)氨苄平板是正常(cháng)製(zhì)備(bèi)並(bìng)在一(yī)個月內使用菌(jūn)株（如(rú)*0）喪(sāng)失F’因(yīn)子(zǐ)檢測背(bèi)景(jǐng)對照，如(rú)果(guǒ)菌落(là)不是藍(lán)色(sè)的(dí)，則(zé)可能(néng)是(shì)宿主菌(jūn)細胞(bāo)丟失F’因(yīn)子(zǐ)（假(jiǎ)設acIqZ.M15 位(wèi)於(yú)宿(sù)主菌的F’因子上，並使(shǐ)用(yòng)正常(cháng)平板）。TA克(kè)隆用於(yú)T-載(zǎi)體(tǐ)係統(tǒng)的感受(shòu)態細(xì)胞(bāo)一定(dìng)要(yào)正確製備(bèi)平板(bǎn)不(bù)適合(hé)藍(lán)白(bái)斑篩(shāi)選。檢測背景對照(zhào)，如(rú)果克隆(lóng)菌(jūn)不(bù)是藍色的(dí)，檢(jiǎn)查(chá)平(píng)板(bǎn)是否含有(yǒu)氨苄/IPTG/X-Gal 以及是(shì)否(fǒu)新(xīn)鮮(xiān)。如平板(bǎn)有問題(tí)，重(zhòng)新製備新(xīn)鮮(xiān)平板含有目的(dí)PCR產(chǎn)物的克隆(lóng)菌.
 
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