上海基(jī)屹為您(nín)解(jiě)析(xī)RNAi抗幹擾檢測

上(shàng)海基屹(yì)為您解析(xī)RNAi抗(kàng)幹(gān)擾檢(jiǎn)測

一．RNAi的(dí)發現(xiàn)
 
     早在1990 年進(jìn)行(háng)轉基因植物(wù)有關研(yán)究(jiū)時偶然(rán)發現,將(jiāng)全長或部(bù)分基(jī)因(yīn)導入植物(wù)細胞後某些(xiē)內源(yuán)性(xìng)基(jī)因不(bù)能(néng)表達,但這些(xiē)基因的(dí)轉錄並無(wú)任(rèn)何(hé)影響,並將(jiāng)這(zhè)種(zhǒng)現(xiàn)象稱(chēng)為基因轉(zhuǎn)錄後(hòu)沉(chén)默（posttranscriptional gene silencing ,PTGS） . 1996 年(nián)在脈(mài)孢(bāo)菌屬(shǔ)（Neurospora） 中發現了相(xiāng)似現象(xiàng),隻不(bù)過(guò)將這(zhè)種(zhǒng)現象(xiàng)命名為(wéi)基(jī)因表(biǎo)達(dá)的(dí)阻抑作用(yòng)（quelling） . 發現dsRNA 能夠(gòu)導致基(jī)因沉默的綫(xiàn)索(suǒ)來(lái)源於(yú)綫蟲Caenorhabditis elegans 的(dí)研究(jiū)
。1995年(nián)康乃(nǎi)爾大學(xué)的研(yán)究人員Guo 和Kemphues 嘗試(shì)用反義RNA 去(qù)阻斷(duàn)par－1 基(jī)因的表(biǎo)達(dá)以(yǐ)探討該基(jī)因的功能,結(jié)果(guǒ)反義(yì)RNA 的(dí)確能(néng)夠阻斷(duàn)par21基因的(dí)表達,但(dàn)是(shì)奇怪(guài)的是,注(zhù)入(rù)正(zhèng)義(yì)鏈RNA 作為(wéi)對照,也同樣阻(zǔ)斷了(liǎo)基(jī)因的(dí)表(biǎo)達
。這個(gè)奇怪(guài)的現(xiàn)象直(zhí)到(dào)3年(nián)後(hòu)才(cái)被解(jiě)開——華(huá)盛(shèng)頓(dùn)卡耐基(jī)研(yán)究院(yuàn)的(dí)Andrew Fire 和(hé)馬薩(sà)諸塞大學(xué)癌(ái)症中心的Craig Mello 將(jiāng)雙鏈dsRNA ——正義鏈(liàn)和反(fǎn)義鏈的混(hùn)合(hé)物(wù)注(zhù)入綫(xiàn)蟲,結果誘(yòu)發(fā)了比單獨注射(shè)正義鏈(liàn)或者反義(yì)鏈(liàn)都(dū)要強(qiáng)得多的基因(yīn)沉(chén)默
。實(shí)際上每個細胞隻要(yào)很少(shǎo)幾個分子(zǐ)的(dí)雙(shuāng)鏈RNA 已(yǐ)經足夠*阻(zǔ)斷(duàn)同源基因(yīn)的(dí)表(biǎo)達
。後(hòu)來(lái)的(dí)實驗表明在(zài)綫(xiàn)蟲(chóng)中注(zhù)入雙鏈RNA 不(bù)單(dān)可以阻斷(duàn)整(zhěng)個綫(xiàn)蟲的(dí)同源基(jī)因(yīn)表達(dá),還(huán)會(huì)導(dǎo)致(zhì)其(qí)*代子代的同源(yuán)基因沉默
。他們將(jiāng)這(zhè)種(zhǒng)現(xiàn)象稱(chēng)為(wéi)RNA 幹擾(rǎo)
。
 
     過(guò)去(qù)認(rèn)為, 哺乳動(dòng)物細胞中(zhōng)不(bù)存在(zài)RNAi 現象,因為較(jiào)長(cháng)的dsRNA 在(zài)哺乳動物細(xì)胞中(zhōng)能誘導IFN（幹(gān)擾(rǎo)素(sù)） 生(shēng)成,並激活STAT 途徑參與的PKR（dsRNA 依賴性激酶） 的(dí)轉錄(lù),同時(shí)dsRNA 本(běn)身與(yǔ)PKR 結合也能令其(qí)激(jī)活(huó),繼而磷(lín)酸化翻譯起(qǐ)始(shǐ)因(yīn)子(zǐ)eIF2a 使之失(shī)活,導(dǎo)致(zhì)非特(tè)異(yì)性(xìng)的蛋(dàn)白(bái)質(zhì)合成障(zhàng)礙;另(lìng)一方麵(miàn),dsRNA 又能(néng)誘(yòu)導細(xì)胞產生多(duō)種(zhǒng)抗病(bìng)毒蛋白的(dí)2′,5′腺(xiàn)苷(gān)合成(chéng)酶,生成   2′,5′腺苷(gān)酸,激活非特異性(xìng)的RNA 酶(méi)L ,發生(shēng)非特異(yì)性的(dí)RNA 降(jiàng)解效應
。現(xiàn)在發現, 隻(zhī)要(yào)dsRNA 短於30bp ,就不會(huì)促(cù)發幹(gān)擾素(sù)效應,同時(shí)又能特異性地降解mRNA ,引起基因沉默(mò),說明dsRNA 在(zài)哺(bǔ)乳動(dòng)物(wù)細胞(bāo)中(zhōng)也能發(fā)揮一(yī)定作(zuò)用,為(wéi)以(yǐ)後(hòu)的基(jī)因(yīn)治(zhì)療(liáo)等RNAi 應用領域提供了新的(dí)研究(jiū)方向
。 
 
二．RNAi的(dí)作(zuò)用機(jī)製
 
     近年(nián)來研究發(fā)現(xiàn),幹(gān)擾(rǎo)性小RNA（ small interfering RNA ,或(huò)short interfering RNAs , siRNA） 是(shì)RNA 幹(gān)擾(rǎo)作用(yòng)（RNAi） 賴以(yǐ)發(fā)生的重(zhòng)要中(zhōng)間效應(yīng)分(fēn)子. siRNA 是(shì)一類長約(yuē)21～25 個(gè)核(hé)苷(gān)酸（ nt ） 的特(tè)殊雙(shuāng)鏈(liàn)RNA（dsRNA） 分(fēn)子,具有(yǒu)特(tè)征性結構,即(jí)siRNA 的序列與(yǔ)所作(zuò)用的靶(bǎ)mRNA 序(xù)列具(jù)有同(tóng)源性(xìng); siRNA 兩(liǎng)條單鏈末(mò)端(duān)為5′端(duān)磷酸(suān)和(hé)3′端羥(qiǎng)基. 此外,每條(tiáo)單鏈(liàn)的3′端均(jūn)有(yǒu)2～3 個突出的(dí)非配(pèi)對(duì)的鹼基RNAi 的(dí)主要過(guò)程(chéng)是(shì),dsRNA 被核(hé)酸酶(méi)切割成21～25 nt 的幹擾(rǎo)性小(xiǎo)RNA （ siRNA） ,由siRNA 介(jiè)導識別並(bìng)靶向(xiàng)切割同源(yuán)性靶mRNA 分(fēn)子. 細(xì)胞(bāo)中dsRNA的(dí)形(xíng)成是(shì)RNAi 的(dí)*步. 細胞中(zhōng)dsRNA 可通(tōng)過多種(zhǒng)途徑(jìng)形成(chéng),如基因組中(zhōng)DNA 反向重(zhòng)復序列的轉錄產物;同(tóng)時(shí)轉錄(lù)反(fǎn)義(yì)和正義RNA ;病毒RNA 復(fù)製中(zhōng)間(jiān)體(tǐ);以(yǐ)及以細胞(bāo)中單鏈(liàn)RNA 為(wéi)模板由細(xì)胞(bāo)或(huò)病(bìng)毒的(dí)RNA 依賴RNA 聚合酶（RdRp） 催化合成dsRNA等. 在綫(xiàn)蟲（ C. elegans） 可以(yǐ)直接注射(shè)dsRNA 或(huò)把(bǎ)綫(xiàn)蟲浸泡在含dsRNA 溶(róng)液中(zhōng)等(děng)方式引入(rù)外(wài)源(yuán)dsRNA ,還可以(yǐ)通(tōng)過喂養(yǎng)表達(dá)正(zhèng)義和反(fǎn)義RNA 的細(xì)菌(jūn)獲(huò)得(dé)dsRNA
。
 
     現已初(chū)步闡明RNAi 的作(zuò)用機製. RNAi 的*步是,dsRNA 在(zài)內切(qiē)核酸酶（一種具有RNase Ⅲ樣(yàng)活性(xìng)的核(hé)酸酶） 作(zuò)用(yòng)下(xià)加(jiā)工裂解形成(chéng)21～25 nt 的由正義和反(fǎn)義序(xù)列(liè)組(zǔ)成的(dí)幹擾性小dsRNA ,即(jí)siRNA.果蠅中RNase III 樣(yàng)核(hé)酸(suān)酶稱為(wéi)Dicer. Dicer 含有解旋(xuán)酶（helicase） 活性以及dsRNA 結合域和PAZ 結構(gòu)域. 已發(fā)現(xiàn)在(zài)Arabidopsis , C. elegans , Schizosaccharomyces pombe 以(yǐ)及(jí)哺(bǔ)乳動物中也存在Dicer 同(tóng)類(lèi)物. RNAi 的第(dì)二(èr)步是,由siRNA 中的反義(yì)鏈(liàn)指(zhǐ)導形(xíng)成(chéng)一(yī)種核(hé)蛋白體,該(gāi)核蛋白體稱(chēng)為RNA 誘導的(dí)沉(chén)默復(fù)合體(tǐ)（ RNA induced silencing complex , RISC） , 由RISC 介(jiè)導切(qiē)割靶mRNA 分子(zǐ)中(zhōng)與(yǔ)siRNA 反(fǎn)義(yì)鏈互(hù)補(bǔ)的區域,從而(ér)達(dá)到幹(gān)擾基(jī)因表(biǎo)達(dá)作用. RISC 由多種蛋(dàn)白成分組(zǔ)成,包括內切(qiē)核(hé)酸酶(méi)，外切核酸酶，解旋酶(méi)和同源(yuán)RNA 鏈搜索活性(xìng)等. 綫(xiàn)蟲C. elegans中(zhōng)的MUT7（一種RNase D樣蛋(dàn)白(bái)） 可能(néng)是一種(zhǒng)3′5′外切核(hé)酸(suān)酶. 此外, PAZPPiwi 蛋(dàn)白家(jiā)族成員(yuán)可能(néng)是RISC中的構成組(zǔ)分(fēn),如(rú)Arabidposis 中的(dí)AGO1 ; N.Crassa 中(zhōng)的(dí)QDE; C. elegans 中的RDE1 等(děng),以上這些蛋(dàn)白(bái)與(yǔ)翻(fān)譯因子eIF2C 同源
。
 
     的(dí)研(yán)究進(jìn)一步揭示,ATP 在(zài)siRNA 介(jiè)導的RNAi 中(zhōng)具有(yǒu)重要作用. 較(jiào)長(cháng)dsRNA 向(xiàng)siRNA 的(dí)轉(zhuǎn)變要有ATP 參與. siRNA 與蛋白(bái)因(yīn)子形成一個(gè)無活(huó)性(xìng)的約360 kD 的蛋白PRNA 復(fù)合(hé)體(tǐ);隨之, siRNA雙(shuāng)鏈(liàn)結(jié)構解旋(xuán)並(bìng)形(xíng)成(chéng)有活性的(dí)蛋白PRNA 復合體(tǐ)（RISC） ,此步具(jù)有(yǒu)ATP 依(yī)賴性. RISC 活(huó)性(xìng)復(fù)合(hé)體對(duì)靶mRNA 的(dí)識(shí)別和切割(gē)作(zuò)用(yòng),這一步可(kě)能(néng)不(bù)需(xū)ATP參(cān)與
。
 
     此外,ATP 使siRNA 5′端帶上磷酸分子,且對(duì)siRNA 的功能具有重(zhòng)要(yào)作用. 上述過(guò)程中siRNA 雙鏈結(jié)構(gòu)解旋很(hěn)可能(néng)是一種(zhǒng)穩(wěn)定(dìng)的(dí)結構改(gǎi)變,因(yīn)為siRNA 雙(shuāng)鏈體(tǐ)與(yǔ)細(xì)胞裂解物(wù)，ATP 等(děng)孵育後再除去ATP 及(jí)其它(tā)輔助(zhù)因子,含有siRNA 的活性復(fù)合體(tǐ)仍(réng)能識別和切(qiē)割靶(bǎ)mRNA 分子
。
 
     siRNA 可(kě)作為(wéi)一種特(tè)殊(shū)引(yǐn)物,在(zài)RNA 依(yī)賴RNA聚(jù)合(hé)酶（RdRp） 作用(yòng)下以靶(bǎ)mRNA 為模(mó)板合成dsRNA ,後者(zhě)可被降(jiàng)解(jiě)形成(chéng)新的(dí)siRNA ;新生(shēng)成的siRNA又可進入上述(shù)循(xún)環. 這(zhè)種過程稱為隨機降解(jiě)性多聚(jù)酶(méi)鏈反應（random degradative PCR） . 新(xīn)生(shēng)的(dí)dsRNA 反復(fù)合(hé)成(chéng)和(hé)降解,不斷(duàn)產生(shēng)新(xīn)的siRNA ,從(cóng)而使靶mRNA 漸(jiàn)進性減(jiǎn)少,呈現基(jī)因沉默現象(xiàng). RdRp 一(yī)般隻(zhī)對所表達(dá)的靶mRNA 發(fā)揮作用,這種在RNAi 過程中對靶(bǎ)mRNA 的特(tè)異性擴增(zēng)作用有(yǒu)助(zhù)於(yú)增(zēng)強RNAi的特異性基(jī)因(yīn)監視功(gōng)能. 每(měi)個(gè)細胞隻需(xū)要少(shǎo)量(liáng)dsRNA 即(jí)能*關閉(bì)相應(yīng)基因(yīn)表達(dá),可見RNAi 過程具有(yǒu)生物(wù)催化(huà)反應(yīng)的(dí)基本(běn)動力學(xué)特征
。
 
     miRNA 與siRNA 的(dí)區別：
 miRNA是單鏈的，而siRNA則是雙鏈的；
miRNA參與正(zhèng)常(cháng)情(qíng)況(kuàng)下(xià)生長(cháng)發育基因調控，而siRNA不參與(yǔ)動物體(tǐ)的正常生長(cháng)，隻有(yǒu)在(zài)病(bìng)毒或其(qí)它dsRNA誘(yòu)導(dǎo)情況下才(cái)產生(shēng)siRNA,作為(wéi)miRNA的*和補充；
 miRNA在(zài)轉錄後水(shuǐ)平調(tiáo)節(jié)基(jī)因表達，推測(cè)在翻譯水平(píng)也(yě)起(qǐ)作用(yòng)，而siRNA為(wéi)轉錄後(hòu)水平調(tiáo)節基(jī)因(yīn)表(biǎo)達調控(kòng)；
Dicer酶(méi)對兩類RNA的加(jiā)工(gōng)過(guò)程，miRNA為不對(duì)稱性，僅來(lái)自含莖－環結(jié)構(gòu)RNA前(qián)體的一側臂(bì)，剩餘(yú)部分很快降解(jiě)，而(ér)這(zhè)種(zhǒng)不(bù)對稱性(xìng)不存在於(yú)而(ér)siRNA加工(gōng)過程中(zhōng)
。