胎牛血清培(péi)養血管(guǎn)平(píng)滑肌細胞(bāo)常(cháng)用的方法

 　　胎(tāi)牛血清培養(yǎng)血管平(píng)滑(huá)肌細胞(bāo)常用(yòng)的方法
　　胎(tāi)牛血(xiě)清(qīng)培(péi)養(yǎng)血管(guǎn)平滑(huá)肌(jī)細(xì)胞常用的方法有貼(tiē)塊法(explant)和酶(méi)解(jiě)離法(enzyme disperse)。下麵一起來(lái)看(kàn)下這兩種方法(fǎ)。
　　1，貼塊(kuài)法
　　方(fāng)法：動(dòng)物經(jīng)頸動脈放血(xiě)後，在(zài)無菌(jūn)操(cāo)作(zuò)下(xià)迅速取(qǔ)出(chū)胸腹主動(dòng)脈段，置於含Hank's液的平(píng)皿(mǐn)中漂洗(xǐ)3次(cì)，將(jiāng)凝塊洗(xǐ)幹淨後剝(bāo)除外膜(mó)的纖(xiān)維脂肪(fáng)層(céng)，然(rán)後(hòu)縱行(háng)切開血(xiě)管，刮(guā)除內膜即(jí)內皮細(xì)胞(bāo)迅速撕(sī)下中(zhōng)膜內(nèi)，中層(céng)，切成約1mm寬的小條，浸泡(pào)在(zài)含血(xiě)清(qīng)的(dí)Hank's液中，並將(jiāng)撕下(xià)小(xiǎo)組(zǔ)織塊種(zhǒng)植於(yú)培養瓶壁。置於37℃恒溫箱，2h左右(yòu)，取出(chū)培(péi)養(yǎng)瓶加入(rù)20% HyClone胎牛(niú)血(xiě)清(qīng)的(dí)培(péi)養液(yè)，再放(fàng)回培(péi)養箱(xiāng)內靜止(zhǐ)培養4天。4天(tiān)後可(kě)見細(xì)胞(bāo)從(cóng)組織中遷移遊出。
　　不同動物(wù)血(xiě)管(guǎn)結構有差(chà)異，豬(zhū)和猴較(jiào)易操作，但小動物如兔，鼠因(yīn)其(qí)血管小，血(xiě)管壁薄(báo)等(děng)特點，使之難以分(fēn)離。另外組織塊(kuài)太(tài)薄(báo)，不(bù)易粘(nián)附(fù)培養基(jī)，也使細胞(bāo)較難(nán)生長(cháng)。為了(liǎo)保(bǎo)證培(péi)養的成功，應注(zhù)意(yì)：
　　①種(zhǒng)植組(zǔ)織(zhī)塊的(dí)數目，如75cm2的(dí)長(cháng)頸瓶(píng)組織塊不得少於30;
　　②根(gēn)據(jù)培養(yǎng)細胞的種(zhǒng)屬加入(rù)適量的不同(tóng)血(xiě)清(qīng)，一般可加(jiā)入牛(niú)血(xiě)清，若小牛(niú)血(xiě)清(qīng)增殖(zhí)效果差，應(yīng)加胎牛(niú)血(xiě)清(qīng)(FBS)，通(tōng)常(cháng)濃(nóng)度(dù)為10%～20%;
　　③培養基(jī)的選擇(zé)：常用的(dí)有DMEM(Dulbecco's modified Eagles'medium)，M199培養(yǎng)基(jī)。培(péi)養(yǎng)兔的(dí)平滑肌細胞用DMEM效(xiào)果較好。
　　2，酶解離法
　　沿(yán)動脈縱軸(zhóu)切(qiē)開後，刮除內皮細胞(bāo)撕下中(zhōng)膜(mó)的內(nèi)2/3，注意不(bù)要(yào)混(hùn)入(rù)內皮(pí)細(xì)胞(bāo)，將組織(zhī)塊切(qiē)成(chéng)1-2mm2，放入加有3mg/ml膠(jiāo)原酶的(dí)無(wú)血(xiě)清(qīng)M199培(péi)養基中(zhōng)，37℃，0.5～1.5h。離心去(qù)上清(qīng)，重復(fù)上述消(xiāo)化步驟，然後再(zài)離心(xīn)(9000r,4min)，收集(jí)細胞，在(zài)5%～10%同種血清(qīng)或HyClone胎牛血(xiě)清的(dí)M199培養基中(zhōng)調(tiáo)整細胞數，然後轉入(rù)30～90mm培(péi)養(yǎng)皿中(zhōng)培養(yǎng)，對於兔(tù)子(zǐ)應加(jiā)入高(gāo)濃度的穀(gǔ)氨酰(xiān)胺(0.2g/L)較(jiào)佳(jiā)。不同研究者在培養基(jī)，酶濃(nóng)度(dù)以及(jí)消化(huà)時(shí)間等的選(xuǎn)擇都有(yǒu)很(hěn)大(dà)的差(chà)異(yì)。
　　綜上所述(shù)，貼(tiē)塊法(fǎ)具(jù)有(yǒu)獲得平(píng)滑肌(jī)細(xì)胞(bāo)純度高，量多(duō)，操作(zuò)簡便的優(yōu)點。但(dàn)用(yòng)貼(tiē)塊法(fǎ)易使平滑(huá)肌(jī)細胞胞(bāo)質(zhì)內肌(jī)絲喪失，亞細(xì)胞器增加。相反，酶解離(lí)法(fǎ)，由(yóu)於(yú)酶(méi)的(dí)作用使(shǐ)細胞(bāo)間失(shī)去連接，細(xì)胞內肌(jī)絲(sī)含量豐富，保持(chí)收縮(suō)型狀(zhuàng)態(tài)。培養(yǎng)平(píng)滑肌細胞常(cháng)取材於(yú)兔(tù)，豬(zhū)，鼠，猴的胸腹(fù)主動脈段。由於(yú)貼塊法(fǎ)和解離(lí)法處理(lǐ)方(fāng)式不同，在細(xì)胞培養的zui初階段(duàn)細胞(bāo)形態(tài)和性質(zhì)存(cún)在差(chà)異。隨著培(péi)養(yǎng)時間(jiān)的(dí)延長，培養(yǎng)環(huán)境趨(qū)於(yú)一(yī)致(zhì)，細(xì)胞特(tè)性上也趨於近似。